枯草芽孢杆菌纤维素酶基因整合载体的构建.pdfVIP

2016-12-20   枯草芽孢杆菌纤维素酶基因 整合载体的构建 1 1 1 1 1,* 聂利波 ， 王占彬 ， 史敦胜 ， 宋洋洋 ， 李旺 (1.河南科技大学动物科技学院，河南 洛阳 471003) 摘要：试验目的：以枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis ，B.subtilis)为宿主，构建纤维素酶基因整合表达载体， 获得能够表达纤维素酶并且降解纤维素的工程菌。方法：通过聚合酶链式反应(PCR)从 B.subtilis LN 基因组 中克隆同源片段M1 、M2 基因片段，以质粒 pGEM-T 为载体，将同源片段M1 、M2 、启动子P43 和葡萄糖 苷酶基因 CelKg 连接在一起构建整合载体 pGEM-Kmpgmt ，并采用双交换同源重组的方式将其转化进入 B.subtilis LN 基因组中。结果：通过 PCR 和双酶切验证整合载体构建完成，并成功整合到野生型 B.subtilis LN 中，获得重组菌B.subtilis Kpg 。刚果红染色结果显示重组菌对羧甲基纤维素钠有降解作用。改良培养基37 ℃ 下摇瓶培养，重组菌B.subtilis Kpg 生长至 18 h 时上清液中纤维素酶活性比野生型B.subtilis LN 提高了 115%。 关键词：同源重组；纤维素酶基因；枯草芽孢杆菌 Construction of cellulase gene Integration vector of Bacillus subtilis 1 1 1 1 1,* NIE Libo ,WANG Zhanbin ,SHI Dunsheng ,SONG Yangyang ,LI Wang (1. College of Animal Science and Technology, Henan University of Science and Technology, Luoyang, 471003, China) Abstract: Aim ：constructing an engineering bacterial strain which can express cellulase degrade the cellulose ， through constructing an integration vector and using Bacillus subtilis as host. Methods ：The homologous fragments M1 and M2 were cloned by polymerase chain reaction from B.subtilis LN genome. The glucosidase gene CelKg, homologous fragment M1, M2 and strong promoter P43 were ligated to the pGEM-T vector by T4 DNA Ligase to construct the integrated vector pGEM-K