基因组改组选育产酯化酶地衣芽孢杆菌-生物通.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，３３（８）：４３４８ 基因组改组选育产酯化酶地衣芽孢杆菌  薛正莲 　刘　阳　王　洲　马琦亚　赵世光　苏燕南 （安徽工程大学生物与化学工程学院微生物发酵安徽省工程技术研究中心　芜湖　２４１０００） 摘要　从高温大曲中筛选到一株产酯化酶的地衣芽胞杆菌Ｇ。采用低温等离子体对Ｇ 进行诱 ２ ２ 变，以筛选酶活提高最多的３株菌株作为亲本。将亲本原生质体灭活后对其进行基因组改组。将 融合后的菌体进行筛选纯化之后，对融合子进行发酵测定其酶活并挑选酶活较高菌株进行传代 ＃ 测定其酶活稳定性。结果表明６融合子酶活最高且稳定为１０．７Ｕ／ｍｌ，相对于初始菌株的５．３Ｕ／ ＃ ｍｌ提高了１０２％。对其发酵液进行气相色谱分析表明，６融合子代谢产一定量的酸类、酯类及醇 类等物质，其中乙偶姻含量达２５６５ｍｇ／Ｌ。 关键词　酯化酶　基因组改组　地衣芽孢杆菌　等离子诱变 中图分类号　Ｑ８１９ 　　白酒是中国传统的发酵食品，有着悠久的历史。 对中国白酒酿造大曲酯化酶菌种的研究主要集中在酵 白酒酿造过程中的微生物主要来源于酒曲、窖泥和糟 母菌、霉菌，对细菌的研究报道还比较少。因此加强对 醅，参与酒精及其香味物质的形成从而赋予白酒特有 大曲中产酯化酶细菌的研究显得很有必要［４］。 的风味。随着现代微生物技术的发展，对白酒酿造技 ［１３］ １　材料与方法 术的认识也将不断深入 。己酸乙酯是浓香型白酒 的主体香，乙偶姻不仅是白酒中很重要的呈香味物质 １．１　材　料 还是对中国白酒酱香型有重要贡献的四甲基吡嗪的前 　　菌种：本实验室保藏的从某名酒厂高温大曲中筛 ［４６］ 体物质 。传统研究表明酒体中的己酸乙酯主要来 选到的产酯化酶地衣芽胞杆菌编号Ｇ。 ２ 自白酒发酵过程中微生物代谢产生的酯化酶作用于己 　　ＧＬ２０Ｃ高速冷冻离心机（上海安亭科学仪器厂）；常 酸和乙醇生成。有关研究表明酵母菌对己酸乙酯的合 压室温等离子体育种机（ＡＲＴＰ）（思清源生物科技）；ＨＨ 成，推论其有两条路径。一条是酯化酶作用己酸和乙 ２恒温水浴锅（金坛市杰瑞尔电器有限公司）；ＳＰＨ２１０２Ｃ 醇而生成己酸乙酯；另一条路径为乙醇、乙酰己酸转移 恒温振荡培养箱（上海世平实验设备有限公司）；气相色 酶（ＡＡＣＴａｓｅ）在己酸辅酶Ａ（己酸ＣｏＡ）之间反应而 谱仪（ＧＣ６８９０Ｍ），白酒专用柱ＣＰＷａｘ５７Ｃ。 ［１］ 　　高渗溶液：０．５ｍｏｌ／Ｌ蔗糖，０．０２ｍｏｌ／Ｌ顺丁烯二 生成的 。 　　大气压辉光放电（ＡＰＧＤ）低温等离子体诱变作为 酸，０．０２ｍｏｌ／ＬＭｇＣｌ．６ＨＯ，用ＮａＯＨ调节ｐＨ为６．７。 ２ ２ 一种新型的诱变手段，其产生的等离子体具有气体温 　　发酵培养基：牛肉膏 ２０．０ｇ／Ｌ，葡萄糖 ２０．０ｇ／Ｌ， 度低，电子浓度温度高的非平衡特性以及活性粒子浓 ＫＨＰＯ１．０ｇ／Ｌ，（ＮＨ）ＳＯ １．０ｇ／Ｌ，ＭｇＳＯ ·７ＨＯ１．０ ２ ４ ４ ２ ４ ４ ２ 度高的特点，能作用于微生物的遗传物质，使其在较短