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酵母双杂交文库常见问题 上海欧易生物 技术支持部 酵母双杂交文库常见问题 目 录 1. 什么是酵母双杂交？2 2. 酵母双杂交的实验原理？2 3. 酵母双杂交的筛选流程？2 4. 欧易生物提供哪些酵母双杂服务？2 5. 为什么水稻等高CG 物种选择Invitrogen 体系而不选择 Clontech 体系？2 6. 欧易生物在酵母双杂文库构建方面有哪些优势？3 7. 欧易生物构建过哪些物种的文库？3 8. 欧易提供的酵母双杂文库有何特色？3 9. 如何判断文库质量？3 10. 如何检测文库的库容、插入片段平均长度、重组率？4 11. Mating 和共转两种筛库方法到底哪种好？4 12. 如何选择合适的核体系进行建库？4 13. 如何确定是选择构建核体系文库还是膜体系文库？4 14. 为什么欧易构建的文库既可以做单杂又可以做双杂？4 1 酵母双杂交文库常见问题 1. 什么是酵母双杂交？ 酵母双杂交系统 （Yeast two-hybrid system ）是在酵母体内分析蛋白质-蛋白质相互作用 的基因系统，也是一个基于转录因子模块结构的遗传学方法。该方法不但可以检测已知蛋白 质之间的相互作用，更重要的在于发现与已知蛋白相互作用的未知蛋白。 2. 酵母双杂交的实验原理？ 细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。反式转录激活因子，例如酵母转录 因子GAL4 在结构上是组件式的（Modular ），往往由两个或两个以上结构上可以分开，功 能上相互独立的结构域（Domain ）构成，其中有 DNA 结合功能域 （DNA binding domain,DNA-BD ）和转录激活结构域（Activation domain ，DNA-AD ）。这两个结合域将它 们分开时仍分别具有功能，但不能激活转录，只有当被分开的两者通过适当的途径在空间上 较为接近时，才能重新呈现完整的GAL4 转录因子活性，并可激活上游激活序列（Upstream activating sequence, UAS ）的下游启动子，使启动子下游基因得到转录。 根据这个特性，将编码DNA-BD 的基因与已知蛋白质Bait protein 的基因构建在同一个 表达载体上，在酵母中表达两者的融合蛋白BD-Bait protein 。将编码AD 的基因和cDNA 文 库的基因构建在AD-LIBRARY 表达载体上。同时将上述两种载体转化改造后的酵母，这种 改造后的酵母细胞的基因组中既不能产生GAL4 ，又不能合成LEU 、TRP、HIS 、ADE ，因 此，酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长。当上述两种载体所表达的融合蛋白能够 相互作用时，功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的报告基因HIS 、ADE 、LACZ 、 MEL1 ，从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落。将阳性反应的酵母菌株中的 AD-LIBRARY 载体提取分离出来，从而对载体中插入的文库基因进行测序和分析工作。 3. 酵母双杂交的筛选流程？ 当我们将已知基因作为诱饵，在选定的cDNA 文库中筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白， 从筛选到的阳性酵母菌株中可以分离得到AD-LIBRARY 质粒，对质粒中的cDNA 片段进行 测序，并对该片段的编码序列在GENEBANK 中进行比较，研究与已知基因在生物学功能上 的联系。 4. 欧易生物提供哪些酵母双杂服务？ 目前市面上常见的核体系和膜体系酵母双杂交文库欧易都可以提供，核体系酵母双杂交 文库包括Clontech 体系和Invitrogen 体系，膜体系是Dual systerm 体系。 5. 为什么水稻等高CG 物种选择Invitrogen 体系而不选择 Clontech 体系？ Clontech 体系过程中需要进行PCR 扩增，而Invitrogen 体系则是直接由mRNA 反转录 即可。高 GC 会影响二链 PCR 的扩增效率，所以一般高 GC 的物种在建库时会优先选择 2 Invitrogen 体