荧光定量pcr检测野芷湖水体气单胞菌数量周年动态-华中农业大学.pdfVIP

8 试验研究 殖与饲料2017 年第10 期 · · 荧光定量PCR 检测野芷湖 水体气单胞菌数量周年动态 1 1 1 1 2 2 1 1 温周瑞 陈 霞 卢伶俐 李 丹 李爱华 李彤彤 叶 嵘 李文华 1.湖北省水产科学研究所，武汉 430077；2. 中国科学院水生生物研究所，武汉 430072 摘要 利用 16S rRNA 基因的特异性引物建立的实时荧光定量PCR 方法对武汉野芷湖水体中的气单胞菌 进行周 检测。以构建的嗜水气单胞菌标准株重组质粒作为标准品绘制标准曲线，结果表明，质粒标准曲线在 9 3 （2 全 各个季节水体中都 2.0 ×10 ～2.0 ×10 copies/ μL 具有良好的线性相关性 =0.999 ）。周 检测结果表明， 存在气单胞菌，但缺乏明显的变化规律，应进一步开展研究，区分水体中致病性和非致病性气单胞菌的比例以及 与疾病发生之间的关系。 关键词 荧光定量PCR ；气单胞菌；养殖水体；周 动态；野芷湖 气单胞菌（ ）广泛分布于自然环境中， 1 材料与方法 属于条件致病菌，其致病菌株可引起多种水产养殖 动物发生疾病，出现不同的感染症状，如出血、体表 1.1 材 料 [1-5] ，给养殖业造 。 溃疡、甲壳变软等 ，并导致高死亡率 1）采样 20 12 5 月～20 13 6 月从武汉市 成巨大的经济损失。不仅如此，气单胞菌还会引起 野芷湖 （北纬 30°28′11.10″，东经 114°20′ [6-7] 2 [14] 人类疾病 ，已成为严重的公共卫生问题。野芷湖 9.94″，面积 1.62 km ，水深 1.5 ～2.5 m ）收集水 是武汉市重要的城市湖泊，实时监测其水体中气单 样。在野芷湖选取3 个采样点，每月定期采样3 ～4 胞菌的数量变化，可及时对水产动物疾病的发生进 次，水样为各采样点0 ～50 cm 的上层水。取样过程 行预警并采取防治措施，对保证该水域的水质安全 所用取样瓶与采样器均灭菌封装，至采样点开包 也具有重要意义。 装。在水面以下0.3 m 处打开瓶盖，灌水，每个采样 环境中微生物监测，传统的微生物学试验方 点重复取样2 次，编号a、b ，取其平均值。取出后，水 法存在诸多不足，如平板菌落计数、血球计数板 样放入冷藏盒，带回实验室检测，检测结果取3 个 计数等计数方法不仅操作复杂、效率低、工作量 采样点细菌数量的平均值。 大，而且测定结果容易受到外界条件和人为主观 2 ）菌种来源。实验所用标准的 影响，误差较大；选择性培养基筛选、生理生化指 DBHS101 菌株由中国科学院水生生物研 标测定等鉴定方法过程繁琐，耗时长[8-9] 。利用实 究所李爱华教授惠赠。 时荧光定量PCR 方法快速检测环境中的微生物， 3 ）主要仪器和试剂。主要仪器 BIO-RAD CFX ）， 不仅简 、快速，而且特异性强、灵敏性高，应用 96 荧光定量 PCR 仪（Bio-Rad ，美国 Tanon 3500 [ 10-12] [ 13]