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葡萄试管苗热处理脱毒技术探究 　　摘要 为加快培育葡萄优良品种无病毒苗木，提高脱毒效率，开展了葡萄试管苗热处理脱毒技术研究。将携带葡萄扇叶病毒（GFLV）、葡萄斑点病毒（GFkV）、沙地葡萄茎痘相关病毒（GRSPaV）、葡萄卷叶相关病毒-1（GLRaV-1）和葡萄卷叶相关病毒-2（GLRaV-2）的8个葡萄品种试管苗进行恒温热处理，对分离成活的62个茎尖进行RT-PCR和ELISA检测。结果显示，62个茎尖中，29个茎尖脱除了上述5种病毒，葡萄卷叶相关病毒-1、葡萄斑点病毒、葡萄扇叶病毒、葡萄卷叶相关病毒-2和沙地葡萄茎痘病毒的脱毒率分别为81.8%、80.0%、78.1%、75.0%和61.5%。采用试管苗热处理结合茎尖培养方法可获得良好的脱毒效果，适用于葡萄无病毒原种母本树的培育。 关键词 葡萄 葡萄病毒 热处理 脱毒 茎尖培养 葡萄栽培历史悠久，在长期的无性繁殖过程中，常常感染多种病毒病害。欧、美等葡萄生产先进国家调查研究结果显示，一些长期栽培的老品种多数带有病毒，很难从中筛选出无病毒单株。我国葡萄也普遍潜带多种病毒，带毒株率多在70%以上，有些葡萄品种带毒株率达100%。葡萄受病毒侵染后，引起树体生长衰退，产量下降，品质变劣，需肥量增多，寿命缩短，严重者导致树体死亡。栽培无病毒苗木既可有效防止病毒病的危害，也可显著提高果品产量和质量。为加快培育葡萄优新品种无病毒苗木，提高脱毒效率，我们开展了葡萄试管苗脱毒技术研究，现将结果报道如下。 1 材料与方法 1.1试材 供试材料为中国农业科学院果树研究所国家落叶果树脱毒中心保存的威代尔、优无核、红地球、夏黑、巨峰、1103P、140R、雷司令共8个葡萄品种的试管苗。 1.2试管苗热处理 将生长势较好的待脱毒试管苗转接到新鲜培养基中，先在室温（25℃）条件下培养15天，然后转移至恒温培养箱中，32℃培养1周，再逐渐升温至37℃，热处理30天后剥取2.0mm茎尖转接到新配制的培养基中。快繁培养基配方为：改良MS+0.5～1.0mg/L BA+0.1～0.2mg/L IBA+蔗糖30g+琼脂5g；生根培养基配方为：1/2 MS+0.1～0.2mg/L IBA+蔗糖20g+琼脂5g。 1.3病毒检测 （1）RT-PCR检测 用二氧化硅法从葡萄休眠枝条中提取总RNA，取10μL总RNA与2μL 0.1μg/μL随机引物5’d（NNN NNN）3’混合，加水至18μL，混匀后95℃变性5min，立即置于冰中冷却2min。再加入反转录混合液：10μL 5×MLV-RT缓冲液、2.5μL 10mmol/L dNTPs、1.0μL 200U/μL M-MLV反转录酶和6.5μL灭菌纯水，经37℃10min、42℃50min、70℃5min合成cDNA。反转录反应后即进行PCR扩增，50μL反应体系中，包括5μL cD-NA、5μL 10×PCR缓冲液、1.0μL 10mmol/LdNTPs、1.0μL 10μmol/L同源引物、1.0μL 10μmol/L互补引物、0.75μL 2 U/μL Taq DNA聚合酶、36.25μL灭菌纯水。 采用该方法对葡萄斑点病毒（GFkV）、沙地葡萄茎痘相关病毒（GRSPaV）、葡萄卷叶相关病毒-1（GLRaV-1）和葡萄卷叶相关病毒-2（GLRaV-2）进行检测，引物见表1，委托上海生工公司合成。 （2）ELISA检测 根据血清检测试剂盒（美国ACD公司）中的ELISA检测程序进行双抗夹心法榆测。采用该方法对葡萄扇叶病毒（GFLV）进行榆测。 2 结果与分析 2.1供试材料带毒情况 对供试品种、威代尔、优无核、红地球、夏黑、巨峰、1103P、140R、雷司令进行带毒情况的检测，结果表明，8个葡萄品种中只有夏黑和红地球受到单一病毒的侵染，其余均感染了2种以上的病毒，其中，威代尔和优无核均带有葡萄扇叶病毒、葡萄斑点病毒和沙地葡萄茎痘相关病毒3种病毒（表2）。 2.2热处理植株及再生植株的生长状况 热处理过程中，所有处理的供试葡萄品种都有叶片变黄、变黑，甚至死亡的现象，但死亡率相对较低，红地球的植株成活率最低，为60.0%，其他品种的成活率都在80.0%以上。热处理结束后，切取2.0mm茎尖进行培养，茎尖的成活率都在50.0%以上，最高的为威代尔，达到了77.8%（表3）。成活茎尖在培养基中生长良好并分化成完整植株。在完成病毒检测后，对无病毒试管苗进行生根培养，最后将获得的无病毒苗移栽到温室和苗床。 2.3脱毒结果检测 将试管苗进行热处理后，分离培养成活了62个茎尖，成活的茎尖继代培养4～5次，每个茎尖的后代达到5～7瓶时进行病毒检测。检测结果显示，29个茎