转基因检测技术和标准物质探究概述.doc

转基因检测技术和标准物质探究概述 　　摘 要：转基因技术在农业领域的应用与发展十分迅猛，相应的检测技术体系也在不断更新与进步。本文从检测技术与标准物质两个方面对当前转基因检测技术体系的研究现状和发展趋势进行了概述。 关键词：转基因；检测技术；标准物质 中图分类号：S188 文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.03.003 转基因技术在提高作物抗性、增加粮食产量、改善农产品品质以及减少农药使用与污染等方面正深刻改变着现代农业。据统计，2012年全球转基因作物种植面积已达1.7亿hm2，超过全球耕地面积的10%，共计60个国家和地区累计审批1 045项转基因作物用于食品、饲料和环境释放，涉及25个物种、196个转化事件[1]。伴随转基因作物种植面积的激增，关于转基因生物及其产品成分对人类健康和生态环境影响的关注度也与日俱增。 目前国际上在转基因检测与标识管理方面已形成部分共识性文件、评价原则及检测标准，但因不同国家和地区的国情与政策导向不同，转基因产品在标签的阈值范围、标识方式等管理制度上还存在较大差异[2-4]。不同的标识制度直接关系到转基因产品的进出口检验、国际贸易互认等诸多问题，加之公众对转基因食品越来越关注，转基因检测技术近年来得到了快速发展和广泛应用。笔者就转基因检测技术及相关标准物质研究现状进行概述。 1 转基因检测技术概况 转基因检测的对象主要是外源插入基因的核酸序列或其蛋白表达产物。针对蛋白的检测，因其抗体制备成本较高，并且由于外源基因的低水平和时空特异性表达、蛋白的不稳定性，以及多种干扰免疫应答物质的存在，使蛋白检测的应用范围受到一定程度的限制。针对核酸的检测方法灵敏度高、适用范围广，是当前转基因检测的主流方法。按目的转基因检测可分成3个层次：一是通过检测通用的遗传元件来初步筛查样品中是否含有转基因成分；二是针对转化事件的指定特征进行品系特异性鉴定；三是定量分析转基因成分所占比重。 1.1 针对核酸的检测技术 聚合酶链式扩增技术（Polymerase chain reaction， PCR）是目前应用最广泛的转基因检测方法，具有高度特异性和灵敏度，可用于定性或定量分析[5]。PCR法按检测对象可分为元件特异性（如p35S、tNOS）[6]、基因特异性（如cry1Ab，cp4-epsps）[7]、构建特异性[8]和品系特异性4种[9-11]。在标准PCR方法基础上还存在多种改良方法，多重PCR、巢式PCR、半巢式PCR在降低成本、提高通量和灵敏度方面具备优势[12]。反向PCR（Inverse PCR）[13]，热不对称PCR（Thermal asymmetric interlaced PCR， TAIL-PCR）[14]和连接介导PCR（Ligation mediated PCR， LM-PCR）[15-16]在侧翼序列扩增和鉴定方面应用广泛。 定量PCR（Quantitative PCR， qPCR）是目前最有效的转基因定量检测方法，包括竞争定量PCR[17]和实时荧光定量PCR法[18-19]，其中后者利用荧光标记可实时监控扩增过程，根据待测物初始浓度与Ct（Threshold Cycle）值成正比原理，可精确定量靶标DNA。实时荧光定量PCR具有自动化和高精度等优点，但实验成本较高，对操作人员有技术要求，一般需要种间特异、低拷贝的内标准基因或标准物质作为参照。 环介导恒温扩增技术（Loop mediated isothermal amplification， LAMP）是由Notomi等人于2000年建立的一种全新的链置换扩增法（Strand displacement amplification， SDA）[20]。该方法针对靶基因的6个区域设计4条特异引物，利用链置换DNA聚合酶在恒温条件下完成复杂的扩增过程，产生阶梯状电泳条带，反应结果还可以通过扩增副产物焦磷酸镁沉淀或特定荧光染料来判断。LAMP法对仪器依赖度低，具有高效、灵敏、直观的特点，但易出现假阳性，在转基因检测中有一定应用[21-24]。 基于核酸的检测方法还包括核酸印记法（Southern blot）、基因芯片法（Microarray）和生物传感器法（Biosensor）。核酸印记杂交能够精确区分高度同源序列，但对样品纯度要求较高，操作流程繁杂。基因芯片法能够一次性对多种DNA序列进行定性、定量分析，具有高通量和自动化的特点[25]。生物传感器法依赖灵敏的电化学技术，通过固定在传感器表面的特异探针与靶标DNA结合后产生的电信号来检测，是一种高灵敏度的检测方法[26]。 此外，越来越多的新技术正不断的应用于转基因检测领域，