DHA对C2C12细胞成脂分化过程中相关基因表达影响.docVIP

DHA对C2C12细胞成脂分化过程中相关基因表达影响 　　摘要：采用胰岛素、地塞米松和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤联合诱导C2C12细胞分化为脂肪细胞，诱导分化后加入100 mmol/L二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid，DHA）。DHA处理8 d后，收集细胞，提取总RNA，采用实时荧光定量PCR方法检测脂肪分化相关基因PPARγ、C/EBPα和ADD1转录表达水平。结果表明，C2C12细胞成脂分化时添加DHA能显著上调PPARγ、C/EBPα和ADD1基因的表达，并且联合添加维生素E后效果更显著。 关键词：二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid，DHA）；C2C12细胞；过氧化物酶体增殖物活化受体γ（PPARγ）；CCAAT增强子结合蛋白α（C/EBPα）；脂肪细胞定向分化因子1（ADD1）；维生素E 中图分类号：Q786；R151.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）16-3987-04 随着人们生活水平的提高，消费者对畜禽的肉品质提出了更高的要求。研究表明多不饱和脂肪酸（PUFA）会影响畜禽的肉品质，如嫩度、多汁性、风味等[1]。肌内脂肪含量是影响肉品质的重要指标，而肌内脂肪沉积是由一系列与脂肪分化相关的转录因子调控，如过氧化物酶体增殖物活化受体γ（PPARγ）、CCAAT增强子结合蛋白α（C/EBPα）和脂肪细胞定向分化因子1（ADD1）等[2]。二十二碳六烯酸（DHA）属n-3系多不饱和脂肪酸（n-3 PUFA），是生物膜上重要的组成成分，为动物生长发育所必须[3]。Kim等[4]研究发现DHA可抑制小鼠前脂肪细胞3T3-L1的分化，而孙超等[5]研究发现DHA可上调小鼠脂肪组织PPARγ基因和FAS基因的mRNA表达水平，但ADD1基因的mRNA表达水平下降。DHA被报道能抑制猪脂肪细胞分化中ADD1基因和FAS基因的mRNA表达[6]，添加抗氧化剂（如维生素E）能阻断DHA的抑制效应[7]。然而，在猪日粮中添加DHA却发现能上调ADD1基因和FAS基因的表达[8]。 成肌细胞是骨骼肌的前体细胞，是一种正常情况下位于成熟肌纤维表面的肌源性细胞。研究表明，成肌细胞具有成脂分化的能力[9]。在小鼠成肌细胞系C2C12细胞中，DHA的代谢产物能作为PPARγ的配体，与PPARγ结合并使其活化[10]，进而调控脂肪酸结合蛋白2（Ap2）和脂联素基因的表达[11]。为进一步探讨DHA对成肌细胞成脂分化过程中脂肪分化相关基因表达的影响，本研究以C2C12细胞为对象，采用实时荧光定量PCR方法检测DHA、DHA和维生素E联合添加对C2C12细胞成脂分化过程中脂肪分化相关基因PPARγ、C/EBPα和ADD1表达的影响。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 主要试剂 DHA、胰岛素、地塞米松、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤和二甲亚砜（DMSO）购自Sigma公司；DMEM（高糖）细胞培养液、胎牛血清（FBS）、青/链霉素（S/P）、胰酶溶液均购自Gibco公司；总RNA提取试剂盒（RNAiso Plus）和反转录试剂盒（PrimeScript？誖RT reagent Kit with gDNA Eraser）购自宝生物工程（大连）有限公司；SsoFast EvaGreen Supermix购自Bio-Rad公司；小鼠成肌细胞系C2C12细胞购自美国ATCC菌种中心；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。 1.1.2 培养液 完全培养液，其组成为：DMEM（高糖）细胞培养液添加10%（V/V）FBS和1%（V/V）双抗。 1.2 方法 1.2.1 C2C12细胞的培养 C2C12 细胞培养于完全培养液中，置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱中培养。待细胞生长至约80%时，去除细胞培养瓶中的培养液，经0.25%（m/V）胰蛋白酶-EDTA溶液消化后，细胞计数，向6孔细胞培养板（Corning公司）接入起始细胞数为4×104个细胞/孔，每孔2 mL培养液，每隔2 d更换新鲜的培养液。 1.2.2 C2C12细胞成脂分化 当细胞生长至约80%时，弃去完全培养液，用PBS缓冲液冲洗3次。加入含10 μg/mL胰岛素、1 mmol/L地塞米松和0.5 mmol/L 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤的成脂分化诱导剂的完全培养液，培养3 d；再加入含10 μg/mL胰岛素的完全培养液培养2 d；然后更换成正常的完全培养液继续培养，每2 d换液一次，观察细胞内脂滴形成情况。 1.2.3 DHA和维生素E对C2C12细胞成脂分化相关基因表达的影响 在C2C12细胞加入成脂分化时，同时添加100 mmol/L