人附睾RNase10基因在大肠杆菌中表达.docVIP

人附睾RNase10基因在大肠杆菌中表达 　　摘要：以人附睾cDNA为模板，PCR扩增RNase10基因，构建pET32b（+）-RNase10体外表达载体，转化大肠杆菌（Escherichia coli）感受态细胞DH5α，挑选阳性克隆，提取质粒转化BL21（DE3），IPTG诱导RNase10基因的表达，采用SDS法检测表达产物，结果显示融合蛋白分子量为24 ku，与预期相符，表明人附睾RNase10基因在大肠杆菌中成功表达。 关键词：人附睾RNase10基因；大肠杆菌（Escherichia coli）；表达 中图分类号：Q786 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）17-4245-03 Expression of Human Epididymis RNase10 Gene in Escherichia coli LIU Xiao-ling，LIU Xue，WANG Min-qiang，WEI Hai-tao （College of Life Sciences，Yantai University，Yantai 264005，Shandong，China） Abstract： Using human epididymis cDNA as template， RNase10 gene was amplified and recombined into prokaryotic expression vector pET32b（+）， which was constructed and transformed into Escherichia coli DH5α. Plasmids were extracted from positive clones， and transformed into BL21（DE3）. Furthermore， the protein expression of RNase10 was induced by IPTG. A band about 24 ku was detected by SDS， showing that RNase10 of human epididymis was expressed successfully in cell of E. coli DH5α. Key words： RNase10 gene of human epididymis； Escherichia coli； expression 收稿日期：2012-11-05 基金项目：烟台大学青年基金项目（SM11Z7） 作者简介：刘晓玲（1976-），女，山东莱州人，讲师，博士，主要从事分子生物研究，（电话）0535-6902638（电子信箱）lxl2008i@163.com。 RNase A超家族（Ribonuclease A superfamily）是结构生物学与生物化学领域的研究热点，研究表明RNase A超家族的成员参与消化、血管生成及先天性免疫等多种生物过程[1]。RNase10（Ribonuclease 10）基因主要表达在附睾的头部，基因表达实验数据表明RNase10与男性生殖功能相关[2]，进一步推测该基因在受精过程中具有重要意义[3]。本研究克隆人附睾RNase10基因，构建了大肠杆菌（Escherichia coli）表达载体并获得蛋白，为进一步阐明RNase10基因在精子相关生理过程中的功能奠定实验基础，对研究男性不育具有重要意义。 1 材料与方法 1.1 材料与仪器 大肠杆菌DH5α、BL21（DE3），载体pET32b（+），T4 DNA连接酶、限制性内切酶及其他工具酶，IPTG，X-gal等购自宝生物工程（大连）有限公司，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司设计合成，其他试剂为分析纯，人附睾cDNA模板由烟台毓璜顶医院惠赠。 DYY-Ⅲ型稳压稳流电泳仪及摇床（北京市六一仪器厂）；5810R型高速冷冻离心机（Eppendorf公司）；电热恒温水浴锅（山东龙口市先科仪器公司）；凝胶成像系统（美国UVP公司）；TC-XP型基因扩增仪（杭州博日科技有限公司）。 1.2 方法 1.2.1 引物设计与合成 根据NCBI数据库中人RNase10基因序列（序列号：NM_001012975）设计引物，对其信号肽切割位点和pET32b（+）载体多克隆位点进行分析，在去除了信号肽的RNase10基因DNA序列两端分别加上KpnⅠ及EcoRⅠ的酶切位点和保护碱基，另外在上游引物处添加肠激酶位点以便在融合表达后获取目的蛋白序列[4]，引物序列为P1，5′-TTGGTACCGACGACGAC