遗传学实验 用GUS基因表达观察启动子功能.docVIP

用GUS基因表达观察启动子功能 摘要 通过GUS基因表达染色程度判定启动子关键序列。 1.引言 在真核生物中，主要通过顺式调控元件启动子和反式作用因子转录因子的相互作用，对基因表达进行调控。启动子的功能可以利用报告基因进行检测。 报告基因GUS基因存在于E.coli等一些细菌基因组内，编码β-葡萄糖苷酸酶。β-葡萄糖苷酸酶是一个水解酶，以β-葡萄糖苷酸酯类物质为底物，其反应产物可用多种方法检测出来。由于绝大多数植物没有检测到葡萄糖苷酸酶的背景活性，因此这个基因被广泛应用于植物基因调控的研究中。 科研工作中发现，盐芥液泡焦磷酸酶基因启动子（TsVP1）在除了种子以外的所有组织中都有活性，它的活性在根和叶中能被盐诱导，尤其在根尖中。为了研究启动子的关键序列，构建了盐芥液泡焦磷酸酶基因启动子（TsVP1）不同长度启动区控制的β-葡萄糖苷酸酶（GUS）载体pCAMBIA1391z（PTsVP::GUS），转染拟南芥，获得转基因拟南芥PT1，PA1和P7。发现PT1，PA1和P7具有不同的GUS活性及盐诱导活性。表明启动区长度对启动子功能有影响，由此推测启动子的关键序列及诱导特点。 2.实验材料 2.1实验材料2.1.1材料 拟南芥种子PT1、PT2、PT7、PT8 2.1.1试剂 配制MS培养基所需的母液，琼脂1 mol/L的NaOH溶液70％乙醇，无菌水， 10％次氯酸钠，琼脂粉，NaCl，1mol/L GUS染色液。 2.1.1器具 量筒，移液枪，烧杯，天平，玻璃棒，滴管，pH计，500 mL锥形瓶，高压蒸汽灭菌锅，培养皿，EP管，人工培养箱，吸管，吸水纸。 2.2实验方法 2.2.1配制MS培养基 MS培养基：Murashige和Skoog于1962年为烟草细胞培养设计的，其特点是无机盐和离子浓度较高，是较稳定的离子平衡溶液，它的硝酸盐含量高，其养分的数量和比例合适，能满足植物细胞的营养和生理需要,因而适用范围比较广，多数植物组织培养快速繁殖用它作为培养基的基本培养基。? 成分 分子量 使用浓度 (mg/L) 大量元素 硝酸钾　 KNO3 101.11 1900 硝酸铵　 NH4NO3 80.04 1650 磷酸二氢钾　 KH2PO4 136.09 170 硫酸镁　 MgSO4.7H2O 246.47 370 氯化钙　 CaCl2.2H2O 147.02 440 微量元素 碘化钾　 KI 166.01 0.83 硼酸　 H3BO3 61.83 6.2 硫酸锰　 MnSO4.4H2O 223.01 22.3 硫酸锌　 ZnSO4.7 H2O 287.54 8.6 钼酸钠　 Na2MoO4.2 H2O 241.95 0.25 硫酸铜　 CuSO4.5 H2O 249.68 0.025 氯化钴　 CoCl2.62 237.93 0.025 铁盐 乙二胺四乙酸二钠　 Na2.EDTA 372.25 37.3 硫酸亚铁　 FeSO24.7H2O 278.03 27.8 有机成分 肌醇 100 甘氨酸 2 盐酸硫胺素　 VB1 0.1 盐酸吡哆醇　 VB6 0.5 烟酸　 VB5 或 VPP 0.5 蔗糖　 sucrose 342.31 30g/L 琼脂　 agar 7 g/L 配制MS培养基： （1）用量筒移液从各种母液中分别取出所需的用量：母液为0 mL，母液、、各mL，加入烧杯中，再加入蔗糖6g，加蒸馏水至175mL左右。 （2）用滴管吸取物质的量浓度为1 mol/L的NaOH溶液，逐滴滴入溶化的培养基中，边滴边搅拌，并随时用pH测培养的pH，一直到pH为58为止(培养基的pH必须严格控制在58)。 （4）同样的方法配制200mL含盐的培养基，在第（1）步中加入2.34g NaCl。 （5）称0.005g左右的琼脂粉与10mL蒸馏水混合，配成0.05%琼脂液。 （6）高压灭菌 第一，码放锥形瓶。将装有培养基的锥形瓶直立于金属小筐中，再放入高压蒸气灭菌锅内。 第二，放置其他需要灭菌的物品。将其他需要灭菌的物品也放入高压蒸气灭菌锅内，如用牛皮纸包裹的培养皿等。 第三，灭菌。待需要灭菌的物品码放完毕，盖上锅盖。在98 kPa、121.3 下，灭菌20 min。 灭菌后取出锥形瓶，让其中的培养基自然冷却凝固 2.2.2培养拟南芥幼苗 （1）培养皿分装培养基 将锥形瓶中的培养基加热融化，在超净工作台上将其趁热倒入四个培养皿，令其自然冷却凝固。 （2） 种子在EP管内经体积分数70％乙醇漂洗l min，无菌水洗l次，等量无菌水和10％次氯酸钠混合浸洗10 min，无菌水洗5遍，最后加入质量分数0．0