大鼠Walker—256移植瘤Cyclin E表达水平和其对化疗药物敏感性的关系.docVIP

大鼠Walker—256移植瘤Cyclin E表达水平和其对化疗药物敏感性的关系 摘要 目的：探究大鼠Walker—256移植瘤中Cyclin E的表达水平同荷瘤大鼠接受化疗治疗后生存率的关系。方法：建立大鼠Walker—256移植瘤模型，利用随机表按照安全随机法随机分为4组，对照组、阿霉素组、紫杉醇组、丝裂霉素组。分别以生理盐水、阿霉素组、紫杉醇组、丝裂霉素予以治疗。绘制各组大鼠的生存曲线、并检测各组大鼠移植瘤内Cyclin E的表达水平。以方差分析统计各组之间Cyclin E表达水平的差异，各亚组间荷瘤大鼠的生存率以Wilcoxon法及Kaplan—Meier法进行生存分析。结果：在各组之间，Cyclin E的表达水平无明显差异（P=0.875）；在各组中，移植瘤内Cyclin E表达水平高的大鼠生存率较低，反之移植瘤内Cyclin E表达水平低的大鼠生存率较高，除丝裂霉素组外（P=1.000），这种差异有显著的统计学意义（对照组P=0.016，阿霉素组P=0.009，紫杉醇组P=0.043）。结论：Cyclin E表达水平的高低同大鼠Walker—256移植瘤对化疗治疗的敏感性有关，对乳腺肿瘤患者进行Cyclin E的检测或可有助于预测患者的化疗效果。 关键词 细胞周期蛋白E大鼠Walker—256化疗 细胞周期蛋白E（Cyclin E）作为一种重要的G1/S期蛋白在恶性肿瘤的演进中扮演着重要的角色，已经被确认是一种癌基因[1]。近年来有最新研究证实对乳腺癌患者的新辅助化疗的失败也同Cyclin E基因的高表达有关[2]。在之前的临床研究中也发现在乳腺癌患者中，Cyclin E的高表达者其预后不良[3]；同时也在体外水平对Cyclin E的表达同肿瘤增值的关系进行了相关研究[4]。为了完整地揭示Cyclin E地表达对恶性肿瘤所产生影响，在体内水平以大鼠Walker—256移植瘤为研究对象，探究Cyclin E的表达水平同大鼠荷瘤后的生存率的关系。 资料与方法 实验材料：Wistar大白鼠81只，体重250～280g，由华中科技大学同济医学院医学动物实验中心提供。所用化疗药物分别为：盐酸阿霉素针，盐酸紫杉醇注射液，丝裂霉素。Walker—256细胞株由武汉市协和医院普外科实验室提供。 实验方法：①大鼠肿瘤模型的制作方法及分组：取1只大鼠以乙醚麻醉后，股内侧活力碘消毒，腹腔注射Walker—256癌肉瘤细胞细胞株，5天后自腹腔抽取腹水，显微镜下计数肿瘤细胞数，用注射器吸取含1×107个肿瘤细胞的腹水，注射到其它80只大鼠股内侧皮下实施肿瘤接种。接种7天后可见接种部位有瘤块出现，抽样病理学检验证实为Walker—256癌肉瘤。接种9天后当瘤块达1cm3时，利用随机表按照安全随机法将荷瘤大鼠随机分成4组[5]，对照组、阿霉素组、紫杉醇组、丝裂霉素组，每组各20只。②荷瘤大鼠的处理：各组大鼠均称重并记录。对照组均经尾静脉注射生理盐水5ml；阿霉素组按照5.33mg/（kg·日）经尾静脉注射5ml阿霉素给予治疗，共注射7天；紫杉醇组按照10.00mg/（kg·日）经尾静脉注射阿霉素紫杉醇给予治疗，共注射7天；丝裂霉素组按照30.00mg/（kg·日）经尾静脉注射5ml丝裂霉素给予治疗，共注射7天。实验组荷瘤大鼠所使用的化疗药物剂量，按照成人化疗药物的标准使用剂量乘以动物及人之间药物等效剂量的换算系数后得出[6]。化疗结束后记录每只大鼠的自然死亡时间。③肿瘤细胞Cyclin E表达水平的检测：所有大鼠死亡后，取出肿瘤组织，以10%甲醛固定，石蜡包埋，4μm连续切片。抗原的检测均使用免疫组织化学中的SP法染色。用已知阳性切片作为阳性对照，用PBS缓冲液替代一抗作为阴性对照。Cyclin E（C—19sc—198）单克隆抗体，SP试剂盒购。具体操作按照试剂盒操作说明进行。结果以出现细胞核或伴细胞质着色判断为阳性，根据阳性细胞所占比例及细胞染色强度进行半定量。从每片中选取5个高倍（×400）视野，每视野计数100个细胞。参照姚广裕等的方法[7]，将阳性细胞计数比例70%计3分，以5个视野的平均比例计算最后的分数；阳性染色的强度则从无染色，弱染色到强染色依此计0、1、2、3分。两项得分相加后0分为“—”，1～2分为“（+）”，3～4分为“（++）”，5～6分为“（+++）”。将“（—）”及“（+）”定义为“Cyclin E低水平表达组”，而具有“（++）”及“（+++）”定义为“Cyclin E高水平表达组”，从而将每组大鼠按照Cyclin E表达水平分为了两个亚组，其中Cyclin E低表达组命名为A组，而Cyclin E高表达组命名为B组。分别为两个亚组大鼠绘制生存曲线。 统计学处理：统计学分析采用SPSS1