分子生物学重要试题及答案.doc

试述利用基因工程的技术调控基因表达的主要方法 （1）、基因表达系列分析技术 基因表达系列分析技术是一种以测序为基础定量分析全基因组表达模式的技术，能够直接读出任何一种类型细胞或组织的基因表达信息。其基本原理是根据理论上任何长度超过9-10个碱基的核苷酸片段可代表一种转录产物的特意序列，因此，选择特定的限制性内切酶分离转录产物中这些代表基因特异性的9-10各碱基的核苷酸序列并制成标签连接、克隆测序，根据其占总标签数的比例即可分析其对应编码基因的表达频率。 （2）、RNA选择性剪切机制 RNA的选择性剪切是指用不同的剪切方式(选择不同的剪切位点组合)从一个mRNA前体产生不同的mRNA剪切异构体的过程。一般将选择性剪切分为如下几类：平衡剪切、5’选择性剪切、3’选择性剪切，外显子遗漏，相互排斥性剪切。可以RT-PCR的方法研究一个基因是否存在选择性剪切。其步骤是：首先以cRNA两端特异性引物或来自不同外显子的引物序列在不同组织来源的RNA样品中进行扩增，观察PCR产物大小是否存在差异。如果发现差异，测序后可以分析出这种差异是否来自于选择性剪切。选择性剪切使一个基因翻译为多种蛋白质序列，是基因表达多样性的重要表现形式。 （3）、原位杂交技术 原位杂交(in situ hybridization,ISH)是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段。通常可以分为RNA原位杂交和染色体原位杂交两大类：1、RNA原位杂交用放射性或非放射性(如地高辛、生物素等)标记的特异性探针与被固定的组织切片反应，若细胞中存在与探针互补的mRNA分子，两者杂交产生双链RNA，就可以通过检测放射性标记或经酶促免疫显色，对该基因的表达产物在细胞水平上作出定性定量分析；2、荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)技术首先对于寡核苷酸探针做特殊修饰和标记，然后用原位杂交法与靶染色体或DNA上特定的序列结合，再通过与荧光素分子相偶联的单克隆抗体来确定该DNA序列在染色体的位置。FISH技术不需要放射性同位素，实验周期短，检测灵敏度高。 （4）定点突变技术 定点突变是重组DNA进化的基础，该方法通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，常用于研究某个氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响，也可用于改造DNA调控元件特征序列、修饰表达载体、引入新的酶切位点等。但目前为止选择氨基酸突变的位点存在一定的盲目性。主要是采用两种PCR方法来实现：重叠延伸技术和大引物诱变法在基因序列中进行定点突变。 （5）RNAi技术 RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA，从而阻断体内靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。其过程一般为：在Dicer的参与下，细胞中的双链RNA首先被降解形成21-25个核苷酸的小片段双链RNA(siRNA)，然后又siRNA中的反义链指导合成一种被称为RNA诱导的沉默复合体(RISC)的核蛋白体，再又RISC介导切割目的mRNA分子中与siRNA反义链互补的区域，从而实现干扰基因表达的功能。同时，siRNA可作为特殊引物，在依赖于RNA的RNA聚合酶的作用下，以目的mRNA为模板合成dsRNA，后者又可被降解为新的siRNA，重新进入上述循环。 (6)一些基本分子生物学手段 在启动子上游构建增强子、细菌培养时加入诱导物诱导产物生成等。 2、论述原核生物和真核生物基因组的异同 1　原核生物的基因组结构特点 1.1　染色体数量少，一般只有一条染色体,即一个核苷酸分子,无细胞核· 1.2　DNA结构特点。大多数为双螺旋结构，少数以单链形式存在，核苷酸大多数为环状,少数为线状·有些细菌有染色体外遗传因子,即质粒DNA。 1.3　基因组小，结构简单，DNA一般只有单一复制起点，基因组中含有数百个至数千个基因，基因组内核苷酸大多数序列用于编码多肽以及tRNA,rRNA等,仅少量的非编码核苷酸序列构成调控元件，基因的编码序列通常是连续的,中间无非编码成分。 1.4　转录单元。原核生物基因组中,功能相关的基因常丛集在基因组的一个或几个特定部位,形成一个功能单位或转录单元，其活性受到同步调控,它们可被转录为多个mRNA分子,叫多顺反子，操纵子是最具典型的模式。 1.5　重叠基因，一些细菌同一段DNA能携带不同的蛋白质信息，即同一段DNA片段能够编码两种甚至三种蛋白质分子。 2 真核生物的基因组结构特点 2.1　染色体数量多,结构复杂·由几个或几十个更多的双链DNA分子组成。存在以核小体为单位的染色质结构,这是原核生物基因不具有的，核小体是绕在4对组