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多管发酵法检测生活饮用水中总大肠菌群 　　摘要：总大肠菌群是指一群需氧及兼性厌氧的在37℃生长时能使乳糖发酵、在24小时内产酸产气的革兰阴性无芽胞杆菌。总大肠菌群既包括存在于人及动物粪便的大肠菌群，也包括存在于其他环境中的大肠菌群。在日常的检测过程中，特别是在饮用水的检测中，总大肠菌群的检测对检测环境、检测人员的操作水平和经验要求都很高，且检测时间长达三天，因此其检测结果的准确率都和那提高。笔者在长期检测中对一些检测过程中出现的问题着重进行了归纳，通过反复的试验，和仔细观察后，摸索出了一些规律和方法，在此加以总结，有助于以提高总大肠菌群检测的高效性和准确性。 关键词：饮用水、总大肠菌群、多管发酵 中图分类号：TU731.5 文献标识码：A 根据总大肠菌群应具有的生物特性，如革兰氏阴性无芽胞杆菌，在37℃24h内能发酵乳糖并产酸产气，能在选择性培养基上产生典型菌落。在检测时可用多管发酵法，以100mL水样中污染的总大肠菌群最可能数（MPN）表示的。不同的方法标准略有差异，但检测步骤大体相同，即：乳糖发酵实验、分离培养和证实试验。按《生活饮用水标准检验方法》微生物指标GB5750.12-2006的规定，总大肠菌群检测的步骤为：2.1.5.1乳糖发酵实验（初发酵）；2.1.5.2分离培养；2.1.5.3证实实验（复发酵）。而检测的难点主要在于步骤2.1.5.1、2.1.5.3中“产酸产气”的确认及步骤2.1.5.2中的菌落形态及染色的确认。初发酵阳性管，不能肯定就是总大肠菌群，经过证实试验后，有时可能成为阴性。经过多次观察发现在复发酵成阳性的样品，在初发酵时都有着一些共同的现象。在此，我们从曾经受过微生物污染水样中选出两个最具代表性的样品（污染1＃污染2＃）为例，加以说明。1、乳糖发酵实验中产酸与产气的判断： 分别取10ml水样接种到5只10ml双料乳糖蛋白胨培养液中，置于36℃±1℃的培养箱内培养24h±2h，如所有乳糖蛋白胨培养管都不产酸产气，则报告总大肠菌群阴性，如产酸产气则进行下一步实验。 “产酸产气”是指水样中的细菌发酵乳糖蛋白胨后产生的一些比较直观的现象。这是判断初发酵是否为阳性的重要依据。试管中小倒管内如有气泡，不论其气泡大小如何即为产气。如有疑问可以用手轻轻打动试管，如有气泡沿管壁上浮，即应考虑可能有气体产生。而“产酸”的确认则相对比较复杂。从原理上讲，“产酸”的判别主要是依据培养基中所含的指示剂成分溴甲酚紫显色情况而定。溴甲酚紫的理论显色范围为5.2—6.8，颜色为黄—紫色。但由于水样中大肠菌种类、数量的不同，其产酸情况往往存在较大的差异。以下为已产气或未产气但已产酸的管的不同颜色（见表1）。 表1、在乳糖蛋白胨中36℃24h培养的显色情况 由于发酵时间对显色的影响很大，所以培养时间应相对一致。培养时间统一为24小时。由此可见阳性管的颜色越浅产酸量越高，而这些黄色或淡黄色的在复发酵中往往会成阳性。2、特征菌落的挑选：挑取菌落数与大肠菌群的检出率有密切关系，只挑取一个菌落，由于机率问题，尤其当菌落不典型时，很难避免假阴性的出现。所以挑菌落一定要挑取典型菌落，如无典型菌落则应多挑几个，以免出现假阴性。检测时需要对初发酵阳性培养基在伊红美蓝琼脂平板上进行分离培养，再置于36℃±1恒温箱内培养18～24h，挑选符合特征的菌落进行涂片、革兰氏试验、镜检。 在接种时，应注意环境和器械的洁净，接种针每次操作都要应注意灭菌避免交叉污染的产生，同时动作要快，以免带入环境中的杂菌，如果取样量过大会导致菌落难以分离，影响特征菌落的选取。涂片时尽量选取不同特征的菌落，常见的有： 深紫黑色，具有金属光泽的菌落； 紫黑色，不带或略带金属光泽的菌落； 淡紫红色，中心色较深的菌落； 粉红色，中心较深的菌落； 粉红色菌落； 乳白色，中心紫黑色的菌落； 乳白色菌落。 总之在平板大肠菌群菌落的色泽、形态等方面较大肠菌更为复杂和多样，而且与大肠菌群的检出率密切相关。把表1中颜色不同的培养液分别接种在伊红美蓝琼脂平板上进行分离培养，培养出的菌落形态各异，将有代表性的菌落按（1）涂片：（2）晾干：（3）固定（4）结晶紫色染色：（5）水洗：（6）媒染：（7）水洗：（8）脱色：（9）复染：（10）水洗：（11）晾干：（12）镜检：的步骤进行检测，各种形态的菌落镜检结果如表2： 表2、伊红美蓝琼脂平板上36℃20h培养的菌落形态 可见大肠菌群菌落呈黑紫色有光泽或无光泽时；淡紫红色，中心较深时；乳白色，中心紫黑色时检出率较高；红色、粉红色菌落检出率较低。 如果把初发酵的检验结果同各个单一菌落进行革兰氏染色的镜检结果进行比较，得到表3结果：