生物素-亲和素偶联放大竞争酶联免疫吸附法测定甲氨蝶呤牟方祥王.docVIP

生物素-亲和素偶联放大竞争酶联免疫吸附法测定甲氨蝶呤 牟方祥,王 恒,吴 红,邹德生,邹庆华,万 萍,方勇飞 (400038 重庆，第三军医大学第一附属医院中西医结合科) [摘要]目的 将生物素-亲和素偶联放大竞争酶联免疫吸附法（BA-cELISA）引入甲氨蝶呤血药浓度检测，建立一种快速、简便、敏感、特异的甲氨蝶呤检测方法。方法 将NH2活性生物素与MTX单抗IgG化学连接，采用亲和素-HRP酶标记系统，建立放大竞争酶联免疫吸附法，连续制备5批试剂盒，对试剂盒进行批内批间精密度、敏感性、特异性、准确性和稳定性进行验证，检测口服MTX的类风湿关节炎患者血清MTX浓度, 并对其检测结果进行判定。结果 建立的生物素-亲和素偶联放大竞争酶联免疫吸附法测定甲氨蝶呤的方法具有很好的敏感性和特异性，检测MTX的灵敏度达到0.087ng/ml，检测下限为0.137ng/ml，检测线性范围为0.1ng/ml~10ng/ml；批内RSD为3.3%~8.7%，平均批内差异为6.5%，批间RSD为7.6%~9.9%，重复性教好，检测回收率为94.2%~112.8%。结论 生物素-亲和素偶联放大竞争酶联免疫吸附法检测MTX，操作简单，具有较好的灵敏度和特异性，在MTX血药浓度监测、快速检测、基层开展具有广阔的应用前景。 [关键词] 甲氨蝶呤；生物素；亲和素；放大竞争酶联免疫吸附法 [中图法分类号] [文献标志码]B [通信作者]方勇飞，E-mail：fangyongfei@ [基金项目]国家自然科学基金面上项目；卫生公益性行业科研专项（201202004）  甲氨蝶呤（Methotrexate，MTX）是一种叶酸拮抗剂，通过抑制叶酸代谢途径中的二氢叶酸还原酶达到抗细胞增殖的作用[1]。大剂量的MTX常用于肿瘤、白血病的治疗，最新的儿童急性淋巴性白血病诊疗方案提出甲氨蝶呤使用剂量为2~5g/（m2·24h），患者血清浓度可高达20μmol/L[2-4]。常用检测方法主要有高效液相色谱法、荧光偏振免疫法、酶放大免疫法[3-7]。近年来MTX用于类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis，RA）、干燥综合征、银屑病关节炎等系统性自身免疫性疾病的治疗，常用剂量为5~20mg/周，患者服药后24h内血清MTX浓度最高为20nmol/L，两者浓度相差了近1000倍[3-9]。传统的检测方法很难检出，现常用高效液相色谱质谱法检测[9-10]，但色谱质谱法样本前处理较复杂，操作步骤也相对繁琐[11]，且色谱质谱仪造价昂贵，检测成本高，不适合与大样本检测及基层开展。因此，建立一种稳定、快速、简便、成本低的MTX检测方法具有重要意义。本实验将NH2活性生物素(NH2-reactive biotin，BNHS)与MTX单抗IgG化学连接，采用亲和素-HRP酶标记系统，建立放大竞争酶联免疫吸附法，可用于检测人体血清中MTX浓度。以期为监测MTX在患者体内的代谢、分布、吸收提供简便、有效的方法。 1 材料和方法 材料 试剂 NH2活性生物素(NH2-reactive biotin，BNHS)、MTX单抗IgG（武汉Elabscience公司），辣根过氧化物酶标记的链亲和素SA-HRP（美国sigma公司），MTX标准品（中国药品生物制品研究所），标记缓冲液(Labeling Buffer，LB)、四甲基联苯胺TMB（重庆予之生物公司）。 设备 洗板仪(BIOTEK ELX50)、酶标仪(BIOTEK ELX800)、恒温孵育箱(上海仪器厂 lw600) 样本来源 实验用口服MTX的RA患者血清为患者检测完肝肾功后血清 方法 1.2.1 NH2活性生物素标记MTX单抗IgG 取1 mg MTX单抗IgG于1.5 mL离心管中，并加入0.5 mL LB；加入15 μL BNHS和475 μL LB至离心管中， 37 ℃恒温箱中避光温育30min。加入适量0.5 mL LB至离心管中，并轻吹打混匀，12 000×g离心10min。 加0.2mL LB至离心管中，轻吹打。将滤芯倒转放置于另一个离心管中，6000×g 离心10min。 1.2.2 BA-c ELISA的测定步骤 用CBS溶液溶解MTX，100μL包被96孔酶标板，4 ℃下放置过夜。次日用SPBST溶液250μL 37℃封闭2h，加入NH2活性生物素标记MTX单抗IgG 50μL和MTX溶液或者待检血清50μL 37℃温育。用300μL PBST洗液洗涤3次，再加入SA-HRP100μL 37℃温育30min，用300μL PBST洗液洗涤3次，加入TMB避光37℃温育15min，加