实验一 蔗糖酶活力测定.doc

实验一 蔗糖酶活力测定 一、目的要求 了解蔗糖酶的性质及3,5–二硝基水杨酸比色法测定蔗糖酶活力的实验原理，熟练掌握其测定方法。 实验原理 蔗糖酶（sucrase, EC 3.2.1.26）又称转化酶，蔗糖在其作用下，水解为D–葡萄糖与D–果糖。酵母细胞含丰富的蔗糖酶（胞内酶），细胞破壁后释放出来的蔗糖酶可以从果糖末端切开蔗糖的果糖糖苷键，使蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，葡萄糖和果糖是还原糖，其含量可通过3,5–二硝基水杨酸比色法测定，从而度量酶活力的大小。 蔗糖酶活力定义为：在35℃实验缓冲液条件下，每3min释放1mg还原糖的酶量为1酶活单位。由于蔗糖酶在碱性条件下极易失活，所以可用碱终止酶解反应。 3,5–二硝基水杨酸定糖法实验原理：利用3,5–二硝基水杨酸溶液和还原糖溶液共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在520nm波长处有最大吸收峰，在一定范围内其吸光度与还原糖含量呈线性关系，可用于还原糖含量测定。 三、试剂和仪器 试剂 1、3,5–二硝基水杨酸试剂（DNS）。 甲液：溶解6.9g结晶酚于15.2mL 10%NaOH，并用水稀释至69 mL，在此溶液中加6.9 g NaHSO3。 乙液：称取255 g酒石酸钾钠置于300 mL 10%NaOH中，再加入880 mL 1%3,5–二硝基水杨酸溶液。 将甲、乙两溶液混合即得到颜色呈黄色的使用液，贮于棕色瓶中，室温下放置7–10天后使用。 1、葡萄糖标准使用液（1mg/mL）：称取干燥的葡萄糖0.1000 g，溶于水并定溶至100 mL。 2、5%蔗糖溶液：称取5.00 g蔗糖用pH5.5 0.1mol/L 醋酸-醋酸钠缓冲溶液配置成100 mL。 3、1mol/L NaOH。 (二)仪器 1、电热恒温水浴锅。 2、721分光光度计。 秒表或手表。 四、操作方法 1、标准曲线制备 试管号 0 1 2 3 4 5 葡萄糖标准 溶液(mL) 0 0.15 0.3 0.45 0.60 0.75 葡萄糖含量（mg） 0 0.15 0.3 0.45 0.60 0.75 水 (mL) 1.0 0.85 0.70 0.55 0.40 0.25 DNS试剂（mL) 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 摇匀，于沸水浴中加热5min，迅速冷却，加水定容至25mL A520nm 使用1cm比色皿，在520nm波长条件下，以试剂空白条零，测定各管吸光值。 用坐标纸绘制标准曲线；或用回归法计算求出以A520nm值为自变量，葡萄糖含量(mg)为因变量的直线方程。 2、蔗糖酶活力测定 吸取稀释的供试酶液2.0mL于试管1中，再加1mL 1mol/L NaOH灭酶，作为对照管。 另取稀释酶液2.0mL于试管2中，然后将1、2号试管及5%蔗糖试剂放入35℃水浴中预热10min。然后分别吸2.0 mL经预热的5%蔗糖溶液加入试管1，2中，立即记时，酶促反应3 min，再向试管2加入1mol/L NaOH 1mL灭酶，摇匀。 取适量的酶促反应液，用测定葡萄糖含量的DNS试剂定糖法，以0号管调零，测定酶促反应液A520nm值，与葡萄糖标准曲线比较，求出酶促反应液中还原糖含量。作2次平行试验。 结果计算 蔗糖酶活力（U/mL）=
式中：V——测定时样品的体积（mL） 实验结果记录： 实验序列 0号管 1号测定管 2号测定管 对照管酶液(mL) / / 酶促反应液(mL) / 水(mL) DNS试剂（mL) 1.5 1.5 1.5 摇匀，于沸水浴中加热5min，迅速冷却，加水定容至25mL A520nm / 蔗糖酶活力 （U/mL） 0 六、问题讨论 定糖实验，不当的操作易引起较大的误差，所以DNS试剂加入时,应尽量准确无损地 加至试管底部,控制沸水浴加热反应时间。 七、思考题 1、蔗糖酶活力测定时，1号对照管并无进行酶促反应，但加入定糖试剂加热后，溶液仍呈现红棕色，原因何在？ 2、酶活测定时用对照0号管调节分光光度计零点的目的是什么？用求葡萄糖标准曲线的试剂空白管调零点可以吗？为什么？