人参皂苷Rb1对高糖培养海马神经元胰岛素信号转导途径影响.doc

人参皂苷Rb1对高糖培养海马神经元胰岛素信号转导途径影响 　　[摘要] 目的：探讨人参皂苷Rb1对高糖培养SD大鼠海马神经元糖原合成激酶（GSK）3β/胰岛素降解酶（IDE）信号转导通路及β淀粉样蛋白（Aβ蛋白）分泌的影响。方法：原代培养新生24 h SD大鼠海马神经元分别接种在不同条件的培养基中，分为正常组、高糖组、氯化锂组以及Rb1组。上述培养基中培养72 h，Western blotting法检测其磷酸化GSK3β（pGSK3β）、总GSK3β（tGSK3β）和IDE蛋白的表达，RT-PCR法检测GSK3β，IDE mRNA的表达，ELISA法检测细胞上清液中Aβ蛋白的分泌。结果：与正常组相比，高糖组p/tGSK3β蛋白比值增加，IDE蛋白及mRNA减少，Aβ蛋白分泌增加（P99%），用前以DMEM培养基配制储存液；DMEM高糖培养基、优质胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶+0.03%EDTA均购于北京协和细胞资源中心；多聚右旋赖氨酸（PDL）购于美国Sigma公司；兔抗鼠pGSK3β，tGSK3β，IDE多克隆抗体购于美国Santa Cruz公司；Aβ42 ELISA试剂盒购于美国BD公司。 DMEM完全培养基的配制：DMEM高糖培养基（180 mL）中分别加入FBS（终浓度10%），Hepes（20 mmolL-1），丙酮酸钠（1 mmolL-1），双抗（青霉素100 UmL-1，链霉素100 mgL-1），谷氨酰胺（2 mmolL-1），神经生长因子（nerve growth factor，NGF）（10 μgL-1）。4 ℃冰箱保存备用。 1.3 仪器 3111CO2培养箱（美国Forma）；PK121R高速低温离心机（意大利ALC）；MultiSkan3酶标仪（美国Thermo）；IX71-A12FL倒置相差荧光显微镜（日本Olympus）；CKX31SF倒置相差显微镜（日本Olympus）；TCS SP2SE激光扫描共聚焦显微镜（日本LEICA）。 2 方法 2.1 海马神经元的分离、纯化与培养 具体步骤见文献[5]，最后接种于0.01%PDL包被的培养瓶或培养板中。 2.2 海马神经元的鉴定 以5×105个/孔的浓度将细胞接种到放有盖玻片的6孔培养板中培养，第3天取出盖玻片行神经元特异性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）免疫荧光鉴定，激光共聚焦显微镜检测NSE的表达情况。具体步骤：用0.01 molL-1PBS浸洗盖玻片，后加入4 ℃预冷的4%多聚甲醛常温固定1 h；0.01 molL-1PBS漂洗3次×2 min，在每个盖玻片加入20 μL 0.1%Triton-X100后常温孵育10 min；0.01 molL-1PBS清洗3次×2 min，然后加入山羊血清封闭液，结合非特异性蛋白，室温孵育20 min；每个盖玻片加入20 μL 1∶10稀释的兔抗鼠NSE多克隆抗体，4 ℃过夜，阴性对照组则以0.01 molL-1 PBS代替一抗；0.01 molL-1PBS清洗3次×5 min，然后在每个盖玻片加入20 μL 1∶50稀释的FITC偶联山羊抗兔IgG，湿盒避光37 ℃孵育1 h；0.01 molL-1 PBS振洗6次×5 min，每个盖玻片加入DAPI工作液常温孵育5 min，湿盒避光保存；使用共聚焦激光显微镜检测，Leica Confocal图像分析软件分析图像，3个视野中阳性神经元的数目占总细胞的比例为神经元纯度。 　　2.3 分组 使用DMEM完全培养基培养海马神经元至第3天时，更换为不同条件的培养基，分为4组：正常组、高糖组、氯化锂组和Rb1组。正常组采用完全培养基培养（含25 mmolL-1葡萄糖），其余均加50 mmolL-1葡萄糖。氯化锂组另加1 mmolL-1氯化锂，Rb1组另加1 μmolL-1人参皂苷Rb1。 2.4 Western blotting法检测神经元内pGSK3β，tGSK3β及IDE蛋白表达水平 将细胞悬液接种到预先用PDL包被的T25瓶中，细胞密度1.5×106个/瓶，6 mL/瓶。待细胞生长至第3天，更换不同条件的培养基。继续培养72 h后，除去培养基，收集细胞。200 μL/孔RIPA裂解液裂解细胞。利用伯乐公司的 Bio-Rad DC Protein Assay Kit 1（Catalog：5000-111）试剂盒测定蛋白浓度。电泳，转膜（转膜缓冲液1×Transfer buffer：Tris 3.02 g，氨基乙酸14.4 g，甲醇200 mL，ddH2O 定容至1 L）。切膜，免疫印迹（抗体稀释度pGSK3β，tGSK3β均为1∶200；IDE为1∶100）。数据处理：将显色后的膜