拟态弧菌OmpU基因缺失株的构建及其生物学特性分析Construction of OmpU gene deletion strain of Vibrio mimicus and analysis of its biological characteristics.pdfVIP

万方数据 万方数据 摘要 拟态弧菌（Vibrio mimicus ，Vm）为人和水产动物共患病病原菌，其侵入水产养 殖动物的体内后，通过黏附 的识别作用下，黏附、定植于易感细胞表面生长繁殖， 产生大量的毒力因子可以作用于宿主内的组织细胞，从而引起水产养殖动物腹水病的 发生，导致大批量的死亡，不仅给水产养殖业带来严重的危害，同时也威胁着人类的 健康。因此，对腹水病防治的研究成为重要问题。我们前期研究发现，拟态弧菌外膜 蛋白U （OmpU ）的N 末端含有黏附素基序，重组OmpU 蛋白具有免疫保护作用， 抗OmpU 抗体具有明显的黏附抑制作用，提示OmpU 蛋白是拟态弧菌的黏附素，但 由于黏附抑制作用有可能是抗原抗体反应造成的空间位阻效应，所以OmpU 蛋白的 黏附作用仍需确认。在此研究背景下，本研究以拟态弧菌高致病性菌株04-14 为亲本 菌株，以OmpU 基因作为研究对象，利用同源重组技术构建OmpU 基因缺失株，并 在此基础上比较分析野生株和缺失株在基本生物学特性、细胞黏附性和毒力等方面的 差异，以期确证拟态弧菌OmpU 蛋白的黏附功能及其所介导的致病作用，从而为筛 选用于防治疾病的黏附拮抗剂奠定基础。主要研究内容包括： 1 重组自杀性质粒pWM91-ΔOmpU的构建 根据GenBank 中登录的拟态弧菌Vm223 参考株的OmpU 基因上、下游序列，质 粒pKD3 序列以及pWM9 1 的多克隆位点，设计4 对特异性引物，以鱼源拟态弧菌04-14 基因组为模板，分别扩增OmpU 基因的上游和下游序列；以质粒pKD3 为模板，扩增 Cm 抗性基因片段；利用重叠PCR 方法获得上、下游同源臂与Cm 抗性基因的融合片 R 段（OmpUR-Cm -OmpUL，2179bp ）并克隆至质粒pUC57 。测序正确后，用Xho ⅠNot Ⅰ 双酶切融合片段和自杀质粒pWM91 ，连接产物转化至宿主菌E.coli S17-1 中，提取重 组质粒，经过酶切后获得大小约为8261bp 和2179bp 两条DNA 条带，分别与pWM9 1 和融合片段的大小一致。DNA 测序结果亦显示3 个DNA 片段序列和连接顺序完全正 确，说明重组自杀性质粒pWM91-ΔOmpU 构建成功。 2 接合转移与OmpU基因缺失株的筛选鉴定 以携带重组自杀性质粒pWM91-ΔOmpU 的E.coli S17-1 为供体菌，拟态弧菌04-14 菌株为受体菌进行接合转移试验。以氨苄抗性标记和蔗糖致死性基因进行双重筛选， 得到疑似 OmpU 基因缺失株。分别用引物对 OmpU-1/OmpU-2 、Cm-1/Cm-2 、 OmpUL-1/Cm-2 、Cm-1/OmpUR-2 对OmpU 基因缺失株进行组合PCR 鉴定，结果分 别扩增出大小为1 072、1 013、1 674 和 1 525 bp 的目的基因片段，测序鉴定结果亦 证明OmpU 基因缺失株构建成功。 I 万方数据 3OmpU基因缺失株的基本生物学特性测定 在构建OmpU 基因缺失株的基础上，对缺失株的遗传稳定性、形态染色特性、生 长特性、培养特性和生化特性等基本生物学特性进行测定。结果发现，连续传代25 代后突变株均能稳定遗传；缺失株较野生株生长速率缓慢，丧失了分解麦芽糖的能力； 但野生株与缺失株的形态染色特性、培养特性和其他生化特性没有明显差异。 4OmpU基因缺失株的细胞黏附性测定 以鲤鱼乳头状上皮瘤细胞（EPC ）为体外细胞黏附模型，对比研究OmpU 基因缺 失株和野生株的细胞黏附能力。将缺失株与野生株分别和EPC 细胞于室温下共孵育 60min，洗去未黏附的细菌后，同时采用显微镜检查法和细菌计数法检测细菌对EPC 细胞的黏附情况。结果发现野生株与缺失株对每个细胞的平均黏