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胰腺癌干细胞分离和耐药探究 摘要：目的 引入流式细胞术SP细胞分选法分离胰腺癌CSC，探索CSC在腺癌耐药中的作用。方法 流式细胞术SP细胞分选法分离胰腺癌PANC-1的SP细胞，吉西他滨干预SP和non-SP细胞，抑制实验检测药物敏感性，流式细胞术检测SP比例变化。结果 流式细胞术SP细胞分选法能够从PANC-1中分离出SP细胞，SP细胞对吉西他滨的抑制增殖作用有较强的耐受性，吉西他滨干预后SP细胞比例上调。结论 胰腺癌SP细胞具有胰腺癌CSC的恶性生物学特征，CSC是胰腺癌耐药的根源。 关键词：胰腺癌；SP细胞；CSC；耐药 胰腺癌预后差，5年生存率不足5%，中位生存期仅6个月[1]，胰腺癌细胞恶性生物学行为的机理复杂，容易对化疗药产生耐药性是主要原因之一[2]，因此研究胰腺癌的耐药机制尤为必要。肿瘤干细胞（Cancerstemcells，CSC）学说认为恶性肿瘤中存在极少数具有成体干细胞特征的细胞亚群，是恶性肿瘤耐化疗药物的根源[2]。本研究引入流式细胞术SP细胞分选法分离胰腺癌CSC，初步探索CSC在胰腺癌耐药中的作用。 1资料与方法 1.1一般资料 人胰腺癌细胞系PANC-1购自上海中科院细胞库，DMEM培养基购自美国Invitrogen公司、胎牛血清购自美国Hyclone公司、胰蛋白酶购自美国Mediatec公司，Hoechest33342购自美国Sigma公司，Verapamil购自美国Sigma公司，吉西他滨（健择，Gemzar）购自美国Lilly公司，超净台购自AIRTECH公司，二氧化碳细胞培养箱购自NAPACO5410，Zseries细胞计数仪购自美国贝克曼公司，流式细胞仪购自美国Morflow，倒置显微镜购自日本Olympus公司，Western-blot转膜仪购自美国Bio-Rad公司，水浴槽购自江苏常熟医疗器械厂。 1.2方法 1.2.1细胞培养与观察 采用体外细胞培养对人胰腺癌细胞系PANC-1进行传代与培养，培养条件严格按照ATCC推荐条件执行；24孔板细胞计数法绘制细胞生长曲线，Zseries细胞计数仪进行细胞计数，获得实验数据。 1.2.2CSC的分离与鉴定 采用流式细胞术SP分选法，分离并鉴定PANC-1的SP细胞亚群具有CSC特性。 1.2.3胰腺癌干细胞对吉西他滨的耐受性检测 吉西他滨干预SP细胞亚群和non-SP细胞亚群，比较两细胞亚群耐受吉西他滨的差异；进而检测吉西他滨干预PANC-1后SP细胞比例。 2结果 2.1吉西他滨抑制浓度测定 见图1。 图1 吉西他滨抑制曲线 PANC-1细胞系用0.1～100uM浓度的吉西他滨处理72h，结果显示：0.1μM吉西他滨处理72h，细胞的增殖活力急遽下降，到吉西他滨1μM的时候，细胞增殖活力基本达到了最大抑制。结合文献报道，本课题选用1μM浓度和10μM浓度作为吉西他滨干预PANC-1的SP细胞亚群和non-SP细胞亚群的实验浓度，以探讨两亚群对吉西他滨的敏感性。 2.2人胰腺癌细胞SP细胞对吉西他滨作用不敏感 见表1，1μM吉西他滨作用PANC-1的SP细胞72h后，平均活细胞数是39346.7，未分选的PANC-1活细胞数是6463.3，而non-SP活细胞数是496.0（P0.05），同样的结果在10μM吉西他滨被发现（P0.05）。表明吉西他滨对SP细胞亚群的增殖活性抑制作用较弱；吉西他滨对non-SP细胞亚群的增殖活性抑制作用较强，SP细胞增殖对吉西他滨的药理作用有耐受性。 2.3吉西他滨诱导PANC-1后SP细胞比例增加 见图2。 图2A 图2B 图2 吉西他滨干预PANC-1后SP细胞比例升高 吉西他滨干预PANC-1细胞后，检测到对Velapamil敏感的SP细胞，其比例升高（图2B），由8.74%±0.33%升高至22.67%±3.21%（图3A），具有统计学差异（P0.05）。提示具有胰腺癌干细胞特性的SP细胞对吉西他滨耐受性较强，non-SP细胞对吉西他滨耐受性较弱，吉西他滨处理后SP细胞存活下来，增加的SP细胞可能大多数就是胰腺癌干细胞，也间接反应SP细胞具有胰腺癌CSC特性。 3 讨论 流式细胞术SP（Sidepopulation）分选法利用干细胞对Hoechest33342拒染的原理，分离出具有干细胞特性的SP细胞，SP细胞在许多肿瘤领域被证实具有肿瘤干细胞特性[3]。获得高纯度的肿瘤干细胞是CSC研究的基础，胰腺癌缺乏公认CSC表面标志物，SP分选法为胰腺癌CSC分离鉴定提供了新的思路。本课题组研究[4]发现人胰腺癌细胞系PANC-1存在Verapamil敏感的SP细胞，含量8.74%±0.3