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人体解剖与组织胚胎学专业毕业论文 [精品论文] bFGF转染羊膜上皮细胞的建立及其对视神经再生作用的初步研究 关键词：视神经再生 羊膜上皮细胞 碱性成纤维细胞生长因子 基因转染 慢病毒 视神经损伤 摘要：目的：视神经损伤后虽然有神经再生的潜力，但由于整个微环境不支持神经再生，所以目前为止因视神经损伤或疾病导致的失明还没有较好的治疗方法，而基因修饰细胞载体的研究可为视神经再生提供新思路。因此，本研究从细胞移植的角度，建立用于基因修饰干细胞移植治疗视神经损伤的人bFGF基因修饰大鼠羊膜上皮细胞，并移植入大鼠视神经损伤模型中，初步观察和探讨该细胞对视神经修复的作用及相关机制。 方法：(1)取妊娠晚期SD大鼠的羊膜组织，贯序消化后进行羊膜上皮细胞原代培养，传代细胞进行免疫荧光细胞化学和RT-PCR鉴定。(2)构建含人NGF分泌肽-bFGF编码基因的慢病毒载体，经测序鉴定后进行慢病毒包装，收获病毒上清。(3)用病毒上清对传代大鼠羊膜上皮细胞进行感染并筛选，经免疫荧光细胞化学、RT-PCR及ELISA法检测基因转染效果，体外培养观察细胞生长活性。(4)用bFGF基因转染羊膜上皮细胞的培养上清对PC12细胞进行培养，以检测所分泌bFGF多肽的生物学活性。(5)将基因转染羊膜上皮细胞及未转染羊膜上皮细胞移植入成年雄性SD大鼠视神经吸断伤模型中，设以下4组：正常对照组；损伤组，于眼球后1.3mm处将微电极玻璃管刺入视神经，完全吸除一段长约0.5 mm的神经，致视神经完全断开，但保持视神经外膜和血管完整，于视神经缺损处注入10μl无血清培养基；未转染细胞组是在损伤组的基础上，于视神经缺损处注入10μl未转染羊膜上皮细胞悬液(8×106个/ml)；转染细胞组是在损伤组的基础上，于视神经缺损处注入10μl转染羊膜上皮细胞悬液(8×106个/ml)。(6)在部分细胞移植组大鼠，制备移植细胞悬液前，用Hoechst33342对细胞进行核标记，术后14、28d经心灌注固定，取视神经冰冻切片，观察标记细胞的数量和分布。(7)部分动物取材前48h，玻璃体注射BDA标记视网膜节细胞，术后28d经心灌注固定，取眼球视网膜铺片，计数BDA标记细胞。其余动物术后28d经心灌注固定，取眼球视网膜铺片，尼氏染色计数视网膜节细胞；取视神经眶内段HE染色观察组织结构和细胞密度变化，免疫组织化学染色SABC法显示GAP-43表达。 结果：(1)体外成功培养获得大鼠羊膜上皮细胞，经免疫荧光细胞化学染色及RT-PCR鉴定后显示，除bFGF外，羊膜上皮细胞能表达上皮特异性标志物CK-19、神经类细胞标志物Nestin、GFAP以及细胞多能性标志分子SSEA-4、Oct-4、Nanog、Sox2、Vimentin等。(2)成功构建出含bFGF基因片段的慢病毒载体质粒，经测序鉴定与GeneBank收录序列一致。(3)成功进行慢病毒包装并收获有较强感染能力的病毒上清。(4)完成对羊膜上皮细胞的感染并筛选得到能稳定表达bFGF多肽的细胞，经免疫荧光细胞化学法染色和RT-PCR法检测，可观察到细胞内有bFGF的表达，与转染前的不表达有明显区别；经ELISA检测显示，转染bFGF基因后的羊膜上皮细胞培养上清中有bFGF多肽的分泌，筛选后3天即可检测到细胞培养上清中bFGF多肽的升高，6天后达到一个较高的水平并能维持稳定分泌。(5)筛选后存活的转染细胞经扩增后，其细胞形态与未转染的细胞相比无明显差异，但其生长活性较未转染细胞明显提高。(6)用bFGF基因转染羊膜上皮细胞的培养上清对PC12细胞进行培养后显示，能明显促进PC12细胞的生长和分化，有突起细胞比例和细胞数较未转染细胞组有明显增加，说明分泌的bFGF多肽具有一定神经营养活性。(7)将Hoechst33342核标记细胞移植入大鼠视神经吸断伤模型后，伤后14、28d取视神经行冰冻切片，可观察到损伤区有大量标记的存活细胞，标记细胞能向受损视神经近侧段和远侧段迁移并沿神经外膜迁移，伤后28d标记细胞有所减少。bFGF转染羊膜上皮细胞可向近侧段即眼球方向迁移至视神经乳头靠近视网膜处，向远侧段可沿残留的神经胶质细胞呈条索状排列并迁移至约2mm远处。未转染羊膜上皮细胞在伤区存活相对较少，迁移距离相对较短。损伤组损伤区未见核荧光的细胞。(8)损伤后28d，BDA标记及尼氏染色视网膜节细胞的计数结果显示，损伤组的节细胞密度较其他各组明显降低；细胞移植组的节细胞密度较损伤组明显增加但仍低于正常组，转染细胞组的节细胞密度又显著高于未转染细胞组。(9)HE染色视神经显示，损伤区有大量细胞存在，呈不规则条索状分布并向两端延伸。视神经损伤后远侧段细胞细胞核明显变小，而细胞移植组的胞核与正常对照组大小相似。伤后14、28d计数远侧段细胞结果显示，损伤组细胞