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人体解剖与组织胚胎学专业毕业论文 [精品论文] EGF-R、IGF-1-R在胎儿骨髓间充质干细胞体外分化为上皮细胞中的作用 关键词：骨髓间充质干细胞 细胞移植 受体阻断剂 体外诱导分化 上皮细胞 摘要：目的：骨髓间充质干细胞（Bone marrow-derived mesenchymal stem cell，BMSCs）具有多向分化潜能。课题组已有实验表明在加入EGF、IGF-1等生长因子的条件培养基诱导下BMSCs能表达CK，向上皮分化。但BMSCs何时表达EGF-R和IGF-1-R以及该受体与细胞分化为上皮细胞的关系尚未见相关报道。本实验拟测定BMSCs EGF-R和IGF-1-R的表达时间；在加入EGF或IGF-1诱导后BMSCs表达EGF-R、IGF-1-R和CK的变化；以及加入受体阻断剂后培养的BMSCs是否还能分化为上皮细胞。拟通过本实验研究EGF、IGF-1诱导BMSCs分化的机制，为BMSCs在细胞移植治疗以及组织工程研究提供理论依据和实验方法。 第一部分胎儿BMSCs表达EGF受体和IGF受体及体外诱导分化 1.收集3～5个月胎龄引产胎儿四肢骨骨髓，分离、培养、扩增获得BMSCs。比较11～13周的标本和20～24周标本获得的BMSCs的生长特点。结果：13周以内标本获得的细胞扩增到P4时，数量多于20～24周标本；首次传代时间早，衰老出现时间晚。 2.检测BMSCs EGR-R和IGF-1R出现时间。从P3开始，用免疫组织化学染色法每天检测EGF-R、IGF-1-R的表达。结果显示：EGF-R首次表达为P4第4d～P5第3d；IGF-1-R首次表达为P5第2d～P6第2d。 3.分别用EGF30ng/mL，IGF-150 ng/mL，EGF30 ng/mL+IGF-150ng/mL诱导P3-BMSCs，设立无生长因子对照组，检测EGF-R、IGF-1-R和CK的表达。结果：EGF和IGF-1诱导组细胞表达EGF-R和IGF-1-R较对照组提前2～4天；CK表达最早出现在P4诱导后2天，对照组P6第4d出现微弱的CK表达。 4.用抗EGF-R抗体2mg/mL或抗IGF-1-R抗体1.5mg/mL孵育P5-BMSCs4h后，分别加入含EGF30ng/mL、IGF-150ng/mL的培养基培养，同时另设4个对照组：EGF30ng/mL，IGF-150ng/mL，EGF30ng/M1+IGF-150ng/mL和空白对照组。检测EGF-R、IGF-1-R和CK的表达。结果：EGF-R和IGF-1-R阻滞后，第4d可检测到CK，但CK+细胞率和强度均低于加入生长因子诱导组（Pamp;lt;0.05），接近空白对照组。 第二部分羊膜体外诱导胎儿BMSCs的分化 1.取10例羊膜，用机械分离和氢氧化铵法去除上皮，制成羊膜结缔组织，光镜观察其表面无上皮细胞。 2.将3.0×105个DAPI标记的P4-BMSCs种植于羊膜上，分别用EGF30ng/mL，IGF-150ng/mL，EGF30 ng/mL+IGF-150 ng/mL联合诱导，同时设无生长因子的羊膜对照组和生长因子诱导的细胞爬片对照组。各组诱导24～28d后，经免疫荧光染色后，CLSM下见羊膜铺片和切片上有DAPI蓝色荧光标记核，同时胞质中有CK绿色荧光的细胞，表明BMSCs已分化为上皮细胞。 3.诱导培养第10d，各组BMSCs表达CK细胞率统计结果显示：单用羊膜或者羊膜浸提液诱导BMSCs分化为上皮的能力强于对照组，Pamp;lt;0.05；羊膜与EGF、IGF-1联合诱导作用强于单用羊膜组，Pamp;lt;0.05；终浓度30ng/mL EGF的诱导作用强于50ng/mL IGF-1，Pamp;lt;0.05。 4.TEM下见羊膜上种植的BMSCs与结缔组织见未见基膜形成，细胞间未见细胞连接。 全文结论： 1.13周以内标本获得的骨髓细胞首次传代时间早，衰老出现时间晚；扩增到P4时，BMSCs数量多于20～24周标本。 2.P4-BMSCs开始表达EGF-R，P5-BMSCs开始表达IGF-1-R。提示此时是施加EGF、IGF-1等生长因子的合适时间。 3.EGF和IGF-1诱导后，EGF-R和IGF-1-R表达CK的时间早于对照组。表明EGF和IGF-1可促进BMSCs表达EGF-R和IGF-1-R，以及BMSCs向上皮细胞分化。 4.P3-BMSCs的EGF-R和IGF-1-R阻滞后，其向上皮细胞分化的时间和数量均低于对照组，证明EGF-R和IGF-1-R可能参与了BMSCs向上皮细胞分化的调控。 5.BMSCs能在去上皮羊膜上生长，并分化为能表达CK的上皮细胞。去上皮羊膜，外源性EGF和