细胞玻片推荐的预处理程序及FISH操作流程.docVIP

FISH操作前骨髓或外周血细胞玻片推荐的预处理程序 试剂100 μg/ml的RNase A60μl 20 mg/ml的胃蛋白酶储存溶液 160 μl 2XSSC （pH 7.0）70%乙醇85％乙醇100％乙醇0.01M HCl: 40 ml 固定液（甲醇:冰乙酸 3:1）甲醇乙酸100 μg/ml的RNase A： 配制RNase A储存溶液（1 mg/ml）：溶解0.001gRNase A于1ml 2XSSC （pH 7.0）中，煮沸10分钟，冷却至室温，-20℃分装储存。 配制RNase A工作溶液（100 μg/ml）：取100μl RNase A 储存溶液（1mg/ml）于900μl 2XSSC（pH 7.0）中，混匀，-20℃ 分装储存。RNase A溶液的配制方法为：将60μlRNase A（100μg/ml）加入至40ml 2XSSC （pH 7.0）中。20 X SSC, pH5.3 氯化钠 88g 柠檬酸钠 44g 去离子水 400ml 充分溶解，室温下12M HCl 调节pH值至5.3，用去离子水定容至500ml。高压灭菌。使用期间2-8℃储存。保存期不要超过6个月，若试剂出现混浊或污染应丢弃。 2 X SSC, pH7.0±0.2 20 X SSC （pH5.3） 100ml 去离子水 800ml 充分混匀，室温下10M NaOH 调节pH值至7.0±0.2，用去离子水定容至1L。使用期间2-8℃储存。试剂配制6个月后应丢弃，若试剂出现混浊或污染应丢弃。乙醇溶液（70％乙醇、85％乙醇） 将700ml、850ml 无水乙醇用去离子水分别稀释至1L，使用期间2-8℃储存。试剂配制1个月后或用于20张玻片杂交后应丢弃，若试剂出现混浊或污染应丢弃。固定液（甲醇：冰乙酸体积比3：1）： 量取30ml甲醇和10ml冰乙酸，充分混合。使用前新鲜配制。 1M HCl： 浓HCl 8.2 ml 去离子水 80ml 用去离子水定容至100ml， 室温储存。试剂配制1个月后应丢弃，若试剂出现混浊或污染应丢弃。 0.01M HCl： 取0.4ml 1M HCl，加去离子水定容至40ml。 20 mg/ml的胃蛋白酶储存溶液： 溶解20mg胃蛋白酶(Sigma, P7000)于1ml 无菌水中，，-20℃ 分装储存。40ml 2XSSC（pH 7.0）溶液37oC水浴中预热-20℃预冷70%乙醇、85％乙醇100％乙醇56℃烤片机。 37oC水浴1．新制备的骨髓或外周血染色体玻片预处理程序 新制备的染色体玻片需在56℃下老化30-60分钟或室温下过夜老化。 根据标本类型不同，将玻片在37℃新鲜配制的RNase A溶液中孵育30至60分钟（例如：骨髓玻片需60分钟）。当加入玻片时RNase A溶液可置于室温。RNase A溶液的配制方法为：将60μlRNase A（100μg/ml）加入至40ml 2XSSC （pH 7.0）中。 室温下于2XSSC（pH 7.0）溶液中漂洗玻片2次，每次5分钟。 将玻片依次置于-20℃预冷的70%乙醇、85％乙醇和100％乙醇中各3分钟脱水。自然干燥玻片。 玻片加热至56℃。 按照FISH操作步骤进行FISH实验。 2．骨髓或外周血涂片预处理程序 自然干燥新制备涂片。确保涂片勿过厚。 置玻片于56℃烤片机上 10—20分钟。 将玻片置于室温100％甲醇溶液中5分钟，取出玻片并除去多余甲醇。 将玻片置于室温100％乙酸溶液中30分钟。 将玻片依次置于－20℃ 预冷的 70%乙醇、85％乙醇和100％乙醇中各2分钟脱水。 自然干燥玻片。 按照FISH操作步骤进行FISH实验。 3．流式细胞仪分选的骨髓或外周血细胞玻片预处理程序 采用流式细胞仪直接将细胞分选到玻片上。 玻片于室温下过夜干燥老化或在56℃ 环境中老化30-60分钟。 将玻片置于固定液（甲醇:冰乙酸 3:1）中20分钟。自然干燥玻片。 在考普林瓶中将60 μl RNase A（100 μg/ml）溶液与37℃ 40ml 2XSSC（pH 7.0）溶液混合，加入玻片后置于37℃水浴箱中15分钟至1小时。同时，将40 ml 0.01M HCl倒入另一考普林瓶中并置于37℃水浴箱中，将160 μl胃蛋白酶储存液加入至干燥预热至37℃的考普林瓶中。当RNase A溶液作用时间即将结束时，将已经预热的40 ml 0.01 M HCl倒入装有胃蛋白酶储存液的考普林瓶中混匀。 RNase A溶液处理完毕后立即将玻片置于37℃胃蛋白酶溶液中5-10分钟。 室温下于2XSSC（pH 7.0）溶液中漂洗玻片次，每次分钟。 将玻片依次置于-20℃ 预冷的 70%乙醇、85％乙醇和100％乙醇中各2分钟脱水。自然干燥玻片。 按照F