糖连接位置的测定课件.pptVIP

（二）分子量测定 1、测定多糖分子量物理方法： 沉降法、光散射法、黏度法和渗透压法等。 2、凝胶过滤法简介： 在凝胶柱上不同分子量的多糖与洗脱体积 成一定的关系。采用一系列结构相似的已知分 子量的多糖做标准曲线，进而测定样品多糖的 分子量。 ◆ 该法用量小、操作较简便。 3、单糖、低聚糖及其苷分子量的测定 ※ 最常用FD-MS、FAB-MS与电喷雾-MS 4、多糖分子量的测定方法 ① 基质辅助激光解析电离质谱 （MALDI-MS） ② 基质辅助激光解析飞行时间质谱 (MALDI-TOF-MS). （三）单糖的鉴定 1．纸层析 ① 展开系统：常用水饱和的有机溶剂 如：正丁醇：醋酸：水（4：1：5上层）BAW 正丁醇：乙醇：水（4：1：2.2）BEW ② 展开方式：上行、下行等 ③ 显色剂：可利用糖的还原性或形成糠醛后 引起的一些呈色反应。例如， ※ 邻苯二甲酸苯胺 ※ 硝酸银试剂（使还原糖显棕黑色） ※ 三苯四氮唑盐试剂 （单糖和还原性低聚糖呈红色） ※ 3,5-二羟基甲苯-盐酸试剂 （酮糖呈红色） ※ 过碘酸-联苯胺（糖、苷和多元醇中有邻二-OH结构显兰底白斑）。 2．薄层层析 ① 采用（硼酸液/无机盐）+ 硅胶 → 制板 ② 吸附剂：硅胶 ③ 显色剂： 除纸层析应用以外，还有H2SO4/H2O或 乙醇液、茴香醛-硫酸试剂、 苯胺-二苯胺磷 酸试剂等。 3．气相层析 ① 将糖制备成三甲基硅醚 ② 醛糖用NaBH4还原成多元醇，制成乙酰化物或三氟乙酰化物。 4．离子交换层析 ① 原理： 糖的硼酸络合物可进行离子交换层析 ② 优点：不必制成衍生物，而直接用水溶液 进行分离（与气相比较） ③ 需要仪器—糖自动分析仪 5．液相色谱 ① 填充材料——化学修饰的硅胶 ② 优点：不必制备成衍生物。适合分析对热 不稳定的、不挥发的低聚糖和多糖。 ③ 缺点：灵敏度不及气相层析高。 ◆ 多糖组成的鉴定 1、必要性：低聚糖、多糖的结构分析，首先要了解由哪些单糖所组成、各种单糖之间的比例等。 2、多糖组成鉴定过程：将苷键全水解，用PC检出单糖的种类，经显色后用薄层扫描仪求得各种糖的分子比（也可用GC或HPLC对各单糖定性定量分析）。 （四）糖连接位置的测定 1、化学方法：多采用甲基化法 ①过程：将糖链全甲基化，然后水解所有的苷键，用气相色谱法对水解产物—甲基化单糖—进行定性和定量分析。 ②甲基化过程：常用箱守法(Hakomori) ③水解过程：通常先用90%甲酸全水解，然后用0.05mol/L H2SO4或三氟乙酸水解。 ④ 气相色谱法定性和定量分析： 选择各种单糖的标准品，分别与水解后得到的各种甲基化单糖进行比较，具有游离-OH的部位就是糖的连接位置，而全甲基化的单糖即为末端糖。 ⑤ 计算过程： 算出所得各甲基化产物相互之间的比例，据此可推测出糖链重复单位中各种单糖的数目。 ①全甲基化 ②水解 游离羟基 游离羟基 2、NMR谱法（了解内容） ① 13CNMR谱法： 目前用来确定糖的连接位置的常用方法 ※ 该法是在归属各碳信号的基础上，以游离苷元和甲基糖苷作为参考化合物，确定产生苷化位移的碳，然后利用苷化位移规则，即可方便地获知各单糖的连接位置。 ② 1HNMR谱法： ※ 先使糖与苷乙酰化，再比较不同类型质子的化学位移。 例如：CHOAc中CH质子的化学位移为4.75~5.4ppm; 而CH2OAc、CH2OR中质子在3.0~4.3ppm；端基质子介于这两者之间。 ※ 通过2D-NMR判定质子的归属，从而得出糖的连接位点。 TSG Z0004-2007(1)基本格式 统一封面、目录、鉴定评审结论、明细表(2)有关填写要求 见附件G 43  43 （四）糖连接位置的测定 1、化学方法：多采用甲基化法 首先将糖链全甲基化，然后水解所有的苷 键，用气相色谱法对水解产物—甲基化单糖 —进行定性和定量分析。 ①定性分析：需要选择各种单糖的标准品 ② 计算各甲基化产物相互之间的比例，推测糖 链重复单位中各种单糖的数目 ①全甲基化 ②水解 2、NMR谱法 ①13CNMR谱法：是目前用来确定糖的连接 位置的常用方法 ※ 该法是在归属各碳信号的基础上，以游离苷元和甲基糖苷作为参考