专题75 蛋白质的提取与分离-高考全攻略之备战2018年高考生物考点一遍过.docVIP

1．蛋白质提取与分离的依据 分子的形状、大小；电荷性质和多少；溶解度；吸附性质；对其他分子亲和力 2．凝胶色谱法 （1）材料：凝胶 多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。 （2）步骤：混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子 原理：当相对分子质量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢；相对分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。 3．缓冲溶液 （1）概念：在一定范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液pH发生明显变化的溶液。 （2）作用：能够抵制外界的酸或碱的对溶液的pH的影响，维持pH基本不变。 （3）配制：通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同pH范围内使用的缓冲液。由弱酸和相应的强碱弱酸盐溶解于水中。如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等。 （4）本实验使用的是磷酸缓冲液(NaH2PO4/Na2HPO4)，目的是利用缓冲液模拟细胞内的pH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观察（红色）和科学研究（活性）。 4．电泳法 （1）概念：指带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。 （2）原理：分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。 （3）类型： 琼脂糖凝胶电泳法：由于琼脂糖本身不带电荷，各种分子在电场中迁移速度决定于所带电荷性质的差异及分子的大小、形状的不同。 聚丙烯酰胺凝胶电泳法：在凝胶中加入SDS，使蛋白质解聚成单链，与各种蛋白质形成蛋白质－SDS复合物，使其迁移速度完全取决于分子的大小。 5．实验操作 实验操作的基本步骤：样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定。 （一）样品处理 （1）红细胞的洗涤： ①目的：去除杂蛋白。 ②为防止血液凝固，应先加入柠檬酸钠。 ③所用洗涤液：是五倍体积的生理盐水（质量分数为0.9%的NaCl溶液）。 ④缓慢搅拌，采用低速短时间离心。 ⑤洗涤干净的标准是上清液没有黄色。 （2）血红蛋白的释放：在蒸馏水和甲苯的作用下，红细胞破裂，释放出血红蛋白。 （3）分离血红蛋白溶液：（方法）离心。 试管中的溶液分为4层，从上往下依次是： ①无色透明的甲苯层。 ②白色薄层固体：脂溶性物质沉淀层。 ③红色透明液体：血红蛋白溶液层。 ④暗红色沉淀层：红细胞破碎物沉淀。 （4）透析： ①方法：取1 mL血红蛋白溶液装入透析袋，将透析袋放入盛有300 mL物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液（pH为7）中，透析12 h。 ②目的：去除样品中分子量较小的杂质。 ③原理：透析袋能使小分子自由进出，而将大分子物质保留在袋内。 （二）凝胶色谱操作 （1）凝胶色谱柱的制作 制作步骤：打孔→挖穴→安管→覆网→纱包→插管。 （2）凝胶色谱柱的装填 材料：实验所用凝胶是交联葡聚糖凝胶。 方法：凝胶用蒸馏水充分溶胀后，配成凝胶悬浮液，一次性缓慢倒入色谱柱内。不能有气泡存在。然后用300 mL物质的量浓度为20 mmol/L的磷酸缓冲液充分洗涤平衡12 h，使凝胶装填紧密。 （3）样品的加入和洗脱 使吸管管口沿管壁将样品缓慢加入色谱柱内，不要破坏凝胶面。待红色的蛋白质接近色谱柱低端时，用试管收集流出液，每5 mL收集一管，连续收集。 考向一 蛋白质提取与分离的方法及原理 1．下列关于蛋白质的纯化方法的叙述，错误的是 A．纯化主要是根据蛋白质以及蛋白质与其他物质之间的理化性质的差异进行的 B．透析法可去除小分子化合物杂质，原理是不同分子所携带净电荷不同 C．通过控制离心速率，可使分子大小、密度不同的蛋白质沉降分层，从而分离不同的蛋白质 D．不同的物质在同一电场中的移动速度不同，因此可用电泳法分离蛋白质 【参考答案】B 2．已知某样品中存在甲、乙、丙、丁、戊五种蛋白质分子，分子大小、电荷的性质和数量情况如图所示，下列有关蛋白质分离的叙述正确的是 A．若将样品以2 000 r/min的速度离心10 min，分子戊在沉淀中，则丙也一定在沉淀中 B．若用凝胶色谱法分离样品中的蛋白质，则分子甲移动速度最快 C．将样品装入透析袋中透析12 h，若分子丙保留在袋内，则乙也一定保留在袋内 D．若用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳分离样品中的蛋白质，则分子甲和分子丁形成的电泳带相距最远 【答案】A 的电泳带相距最远，D错误。 考向二 蛋白质提取与分离的实验操作 3．红细胞中含有大量血红蛋白，我们可以选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液进行实验来提取和分离血红蛋白。下列对血红蛋白提取和分离的叙述，错误的是 A．血红蛋白提取和分离一般按照