兔出血症病毒VP60蛋白的原核表达及检测方法初步应用研究.pdfVIP

中国畜牧兽医学会生物制品学分会第十次学术研讨会论文集 兔出血症病毒VP60蛋白的原核表达及检测方法初步应用。 刘怀然1，胡迎东2，陈洪岩1，李昌文1，关云涛1，曲连东1# (1中国农业科学院哈尔滨兽医研究所；2黑龙江省实验动物质量监督检验站，哈尔滨150001) [摘要]VP60是兔出血症病毒(RHDV)的主要结构蛋白，也是免疫原性蛋白，与诱导抗病毒免疫反应直接相关，因而也 blot鉴 定结果表明，重组蛋白可被RHD阳性血清特异性识别，具有相应的抗原性。将表达蛋白经SDS—PAGE电泳切胶纯化后免疫 性后，作为包被抗原初步建立了间接ELISA方法，并检测了48份兔血清样品，与全病毒间接EI-SIA试剂盒检测结果相同。实 验结果表明，用原核系统表达的VP60蛋白，可以作为RHD新型诊断试剂的候选抗原。 [关键词]兔出血症病毒；衣壳蛋白；VP60基因；原核表达；诊断 兔病毒性出血症(Rabbit Disease，RHD)是危害养兔业和实验兔的一种烈性传染病，发病率和 Hemorrhagic 死亡率都很高。因此国标规定普通级实验兔必须进行疫苗接种，抗体水平经监测达到保护效价，才可以安全 的用于试验研究。RHDV缺乏体外繁殖系统，所以RHD的诊断和预防制剂一直利用的是来自感染兔的肝脏 组织，成本高，抗原不易纯化，也不符合动物福利的要求。使得研究者更倾向于利用分子生物学手段进行新 型诊断试剂及疫苗的研制和开发。 多聚蛋白前体，该前体被病毒蛋白酶进一步分解为衣壳蛋白(VP60)和非结构蛋白。除基因组RNA外，在病 蛋白，与诱导抗病毒感染的免疫反应直接相关心j，在新型诊断制剂、疫苗的研制中具有十分重要的应用价值。 1材料和方法 1．1 材料 DNA 盒购自Sangon公司；EXDNA聚合酶、T4 Tag Purification 和原核表达载体pPRoEXTMHTa由本室保存。ProBondsystem为Invitrogen产品。 1．2方法 1．2．1基因扩增 pPRoVP60。 blot 养，0．6～1mM的IPTG常规诱导，SDS～PAGE分析表达蛋白，用RHD阳性血清进行Western 鉴定。 *基金项目：科技基础性工作专项资金项目(实验动物质量监测试剂盒标准化与应用研究，项目编号：2001DEB20055) 作者简介：刘怀然(1974一)，女，内蒙占赤峰人，助理研究员，硕士，主要从事分了病毒学和实验动物质量监测工作。 胡迎东，沈阳农业大学硕士研究生。 #：通讯作者，qld@0451．corn ～135— ofthe10th of ofAnimaland Proceedinss SymposiumBiolo$icalBranch,Chinese——AssociationVeterinary——Scienc—e— 研磨液测血清效价。 Purification 1．2．4蛋白纯化表达蛋白包涵体经充分洗涤，用ProBondsystem纯化，收集洗脱液稀释蛋白浓 PBS透析后，用PEG20000适当浓缩，测定蛋白含量，小量分装一70℃保存。 1．2．5间接ELISA方法建立 未诱导菌液离心、洗 涤、超声裂解后低速离心取上清液，按适当比例加入 血清稀释液中，以消除被检血清的非特异性。用棋盘 滴定法，将纯化的VP60蛋白在10ug／ml浓度左右设 几个稀释度包被ELISA板，阴、阳性血清自1：100倍 比稀释进行测定。以P／N值大，阳性血清光密度值 在1．0左右，阴性血清光密度值0．2的抗原浓度为 最适包被浓度；选择A490nm光密度值为0．8左右的 血清稀释度作为阳性