兔关节滑膜细胞的分离、培养和纯化研究.pdfVIP

论文汇编 第六届中南地区实验动物科技交流奇 兔关节滑膜细胞的分离、培养和纯化水 黄世峰’，肖长虹2，顾为望‘，张嘉宁1，扬敏2，陈德超2 (1．南方医科大学动物实验中心，广东广州，510515； 2．南方医科大学南方医院风湿科，广东广州，510515China) 【摘要】目的探讨兔关节滑膜细胞的体外分离、培养和纯化方法。方法无茵条 件下，从6月龄新西兰白兔的膝关节囊内剪取滑膜组织，采用组织块培养法和酶消化法 分离滑膜细胞。经台盼蓝拒染计数，将细胞按lxl06接种于培养瓶，传代培养。结果经 反复贴壁和多次消化达到彤态学上的纯化要求，活性率为96％，纯度达95％以上，培养 的细胞具有成纤维细胞形态和特征。结论本研究建立了简单易行的滑膜细胞分离、 培养和纯化方法。 【关键词】关节；滑膜细胞；分离；培养；纯化 炎症性关节炎的一个最明显特征是滑膜衬里层滑膜成纤维细胞的增生[I】。应用组织工程学原理， 对体外滑膜组织的研究，成为目前研究热点。本文通过对兔膝关节滑膜细胞的体外分离、培养和纯化 实验研究，可快速简便获得大量较纯的滑膜细胞，能满足滑膜病理研究和动物模型的建立，为临床滑 膜疾病(类风湿关节炎、创伤性滑膜炎、滑囊炎、骨关节炎等)的诊治提供指导。 1材料与方法 1．1材料 市汇通空调净化设备厂)等。 白酶(Gibco，美国)；Ⅱ型胶原酶(Sigma，美国)及其他细胞培养的常规化学药品和试剂。 1．1．3取材6个月龄新西兰兔(南方医科大学试验动物中-tL,提供)，于耳缘静脉注射空气处死。在通 风厨内，严格消毒的条件下打开四肢膝关节，用眼科镊撕脱(或剪切)位于关节腔内侧面的滑膜组织。 放人盛有DMEM培养基的青霉素小瓶中，低温保存。 +广东省科技计划项目(NO．2004860301007) 通讯作者：顾为望 第六祷中南地区实验动物科技变流舍 论文汇编 1．2原代培养 1．2．1 组织块培养 将术中取下的组织块立即带人准备好的超净工作台，在培养皿内修剔去表面 心管中，再用D—Hanks液清洗，至洗液清透。轻轻晃动后静置5min，待组织块沉底即可去上清液。 培养箱中培养2—4h后，轻轻将培养瓶翻转，组织块面朝上，向其加入3～5ml完全培养基，再将培养 瓶轻轻地翻转过来，使液体慢慢浸覆组织块，在培养箱中静置培养。2天后观察，如果情况良好， 在倒置显微镜下可见组织块边缘有椭圆形、三角形或不规则梭形成纤维型细胞长出。一般地，7d 后组织块周边有少许较明显的成纤维细胞长出。以后逐渐增多并向四周呈放射样生长。约2周即可 长满瓶底的90％以上。细胞问也有许多非成纤维样细胞长出，形态各异。当两组织块相遇时，细胞 交叉重叠相连生长成片。 内振荡消化20—30rain。镜检如发现组织已分散成绑胞团块或单个细胞时，则加入完全培养基5lIll 再用D-Hanks液清洗2次，最后加入完全培养基轻轻吹打细胞团，制成细胞悬’液，计数。将悬液 分装于已盛有完全培养基的培养瓶中，用“十”字法轻轻晃动使细胞均匀分布完全培养基内，置 37．06C、5％C02培养。隔日观察，液体微混，有粉尘状物沉淀于瓶底，圃细胞满视野成片状，少 量似成纤维型细胞散布其问。1N后镜下观察成纤维细胞较多，期间视培养基颜色的改变而换三 分之一或半液，加入新鲜培养基，静置培养。以后每3d观察1次，细胞呈簇状生长，约3周后可长 满瓶。 i．3滑膜细胞活性鉴定、计数移取细胞悬液9滴入离心管中，加l滴toga。的台盼蓝渡，吹打混匀，置2— 4min，取l滴均匀分散于细胞计数板，镜下观察，死细胞被染成淡蓝色，而活细胞拒染。根据下列公式 性细胞总数“大格细胞总数。 1．4传代培养、分离和纯化当原代培养的细胞长满瓶底成片时，应进行传代培养，方法参照文献”】。 滑膜细胞传代后约4—8h贴壁变形，呈短胖梭形，突起少见，有少许圆形细胞混杂其问，传代后生长较 快，传代后约一周可长满瓶底。分离和纯化，根据“自然纯化”、“酶消化法”和“反复贴壁”方法相结合 ”1，逐步获得纯的成纤维细胞。纯化时每次消化时间约3～5min，镜下观察梭形细胞变成圆形、细胞间距 较大，甚至细胞有游离趋势时，应加数滴完全培养基。吹打均匀终止消化。以1000r／minx5m