原代大鼠血管平滑肌细胞的体外培养.docVIP

精品论文 参考文献 原代大鼠血管平滑肌细胞的体外培养 周振宇 陈桂秀 刘涛 （四川省南充市川北医学院第二临床医学院lt;南充市中心医院心血管内科gt; 四川南充 637000） 【中图分类号】R394 【文献标识码】A【文章编号】1672-5085（2012）48-0011-02 【摘要】 目的 方法 采用组织贴块法和酶消化法相结合的方法原代大鼠血管平滑肌的培养。采用差速贴壁分离法来纯化细胞；通过形态学观察和抗alpha;-平滑肌肌动蛋白细胞免疫荧光法鉴定细胞。结果 通过倒置显微镜观察，平滑肌细胞多呈梭形，并相互交织排列而呈现典型的“峰-谷”状生长。细胞传至7-8代时出现细胞老化。抗alpha;-平滑肌肌动蛋白细胞免疫荧光法鉴定细胞高倍镜下可见胞质内大量红色、与细胞长轴平行的alpha;-平滑肌肌动蛋白丝。结论 组织贴块法和酶消化法相结合成功进行了血管平滑肌培养，且培养周期短，操作简便。 【关键词】大鼠 血管平滑肌细胞 细胞培养 血管平滑肌细胞（VSMC）是血管中层的主要细胞成分。在动脉粥样硬化的形成与发展中，血管平滑肌细胞的迁移与增殖起着重要的作用[1]，也与冠状动脉旁路移植术（CABG）后移植血管和经皮冠脉腔内血管成形术（PTCA）术后相关血管病变处再狭窄的发生相关[2]。VSMC的体外培养是进行相关基础研究的基础。本研究参照相关文献[3,4]并改进进行原代VSMC的分离与培养。 1 材料与方法 1.1 实验动物 200～250g清洁级雄性SD大鼠，购自川北医学院实验动物中心[合格证书号：SCXK（川）2008-18]。室温颗粒饲料喂养，常规饮水。 1.2细胞的分离与培养 大鼠颈椎脱臼致死，放入消毒后的手术台。予75%的酒精消毒皮肤，沿腹中线由膈下剖开至颈部，用眼科镊翻开左侧肺叶，在脊柱左前找到胸主动脉。用眼科镊及眼科剪分离并取出胸主动脉并放入盛有PBS的培养皿中（含100U/mL青霉素，100mu;g/mL链霉素），迅速转入细胞培养室的超净工作台。在超净工作台中培养皿内反复冲洗去除血污，用两把眼科镊夹住血管反方向用力剥除外膜，然后转移入另一PBS（含100U/mL青霉素，100mu;g/mL链霉素）的细胞培养皿中。用眼科剪剪去血管外的小分支，再转移入盛有含20％FBS的DMEM（含100U/mL青霉素，100mu;g/mL链霉素）的细胞培养皿中。剪开血管腔，在血管内膜面上用眼科弯镊轻轻刮除血管内膜层。最后将剪开的血管转移入另一盛有含20％FBS的DMEM（含100U/mL青霉素，100mu;g/mL链霉素）的细胞培养皿中，用眼科剪将血管段剪成约ltimes;lmm大小的组织块。用弯头吸管将组织块转入25ml细胞培养瓶中（培养瓶底面预先用培养基浸湿），均匀平铺在培养瓶的底面，组织块的间距约0.5cm，在组织块上滴2-3滴含20％FBS的DMEM（含100U/mL青霉素，100mu;g/mL链霉素）。将培养瓶轻轻翻转使瓶底朝上，旋松瓶盖，于培养箱（37℃，5％CO2）内放置3h，待组织块干涸与瓶底贴附后将培养瓶翻转平放，向瓶中加入含20％FBS的DMEM（含100U/mL青霉素，100mu;g/mL链霉素）3ml，继续放入培养箱（37℃，5％CO2）内。3天后再向培养瓶中加入含20％FBS的DMEM（含100U/mL青霉素，100mu;g/mL链霉素）3ml，继续放入培养箱（37℃，5％CO2）内静置。2天后取出培养瓶，倒置显微镜下观察可见贴壁的组织块周围有少量细胞生长，用吸管将组织块从培养瓶中转移到离心管。离心管离心1500转/分times;5分钟，弃去上清液，加入0.25%胰蛋白酶，于37℃水浴10分钟；组织块呈絮状,加入含20％FBS的DMEM终止消化，再次离心离心1500转/分times;5分钟，弃去上清液；加入含20％FBS的DMEM到离心管，用吸管吹散后细胞后转入25ml培养瓶放入培养箱（37℃，5％CO2）内继续培养。其后每3天换液1次。 1.3细胞的传代与纯化 待原代培养的细胞达到80-90％融合时进行细胞传代。吸出原培养基后加入5mlPBS，轻轻晃动培养瓶，再将PBS吸出。加入0.25%胰蛋白酶后将培养瓶平放并轻轻晃动，在倒置显微镜下观察，见细胞回缩变圆、细胞团开始有脱落时立即加入含20％FBS的DMEM来终止消化；用吸管均匀吹打,使细胞脱离瓶底而悬浮；将细胞悬液转入离心管，离心1500转/分times;5分钟，弃去上清液；加入含20％FBS的DMEM到离心管，用吸管吹散后细胞后将细胞一分为二接种到新的培养瓶中继续培养。 采用差速贴壁分离法来纯化细胞