微型中空纤维反应器用于药物肝毒性研讨.pdfVIP

浙江大学硕士论文 摘 要 随着大量新药的发明，亟需各种有效的模型来评价药物的肝毒性。传统的动 物模型有时间长、操作繁琐与费用高的缺点，不适用于药物肝毒性的高通量筛选。 近来，各种体外药物代谢模型受到了广泛关注，在药物肝毒性研究中，大多采用 规模趋向微型化的多孔板原代肝细胞培养法。但多孔板培养细胞不能长期保持肝 细胞特异功能，这制约了原代肝细胞模型在药物研究中的应用。本实验的目的在 于寻找新的适合药物肝毒性研究的原代肝细胞模型，希望能代替多孔板培养法应 用于药物肝毒性的研究中。 本文分五个部分。第一部分综述了与肝毒性相关的新药筛选现状和存在的问 题，以及肝细胞体外培养的研究进展。并提出了本文的研究思路：将大型的生物 人工肝反应器微型化，建立一种细胞三维培养的微型反应器，用于体外药物肝毒 性的研究。 第二部分通过一系列定性和定量实验寻找合适的材料构建微型反应器。得到 了一种由 100KDa 聚砜中空纤维丝，透气硅胶管，硅胶塞构成的微型反应器，并 以鼠尾胶原为包埋基质将细胞培养于中空纤维丝腔内。包埋于此种反应器内的大 鼠肝细胞能存活 14 天以上，而且能较好保持肝细胞功能和 CYP450 活性。 第三部分主要评价微型反应器用于药物肝毒性研究的可行性。结果发现微型 中空纤维反应器对不同浓度（2.5~20 mmol/L ）醋氨酚毒性的敏感性均高于单层 培养方式，并更接近体内药物毒性实验的结果，说明此种培养方式能较好保持 CYP450 酶活性并能模拟体内微环境。本实验还采用低浓度的利福平（10 mg/L） 和异烟肼（15 mg/L）考察了微型中空纤维反应器用于药物低剂量长期肝毒性研 究的可行性，发现药物对中空纤维反应器包埋细胞的肝毒性在用药 3 天后才能观 察到，而单层贴壁细胞在 5 天的培养中未发现有明显的药物肝毒性。 第四部分讨论了微型中空纤维反应器作为体外保肝药物模型的可行性。实验选 用醋氨酚作为肝毒性药物，谷胱甘肽作为保肝药物，结果发现，对于单层贴壁培 养的细胞，谷胱甘肽的保护作用在加药 24h 后开始下降，而对于微型中空纤维反 应器包埋细胞，谷胱甘肽的保护作用能持续 5 天。该结果预示，微型中空纤维反 i 浙江大学硕士论文 应器能更好保持与 GSH 保肝作用相关的酶活性，是一种比单层培养更合适的体外 保肝药物研究模型。 第五部分总结全文并展望了微型中空纤维模型用于药物代谢研究、中药筛选研 究和以人肝细胞代替大鼠肝细胞用于临床药物反应预测研究的应用前景。 关键词：大鼠肝细胞 微型中空纤维反应器 单层贴壁培养 药物肝毒性 醋氨 酚 利福平 异烟肼 谷胱甘肽 ii 浙江大学硕士论文 Abstract With the rapid development in discovery of new drugs, highly effective in vitro models were needed to evaluate drug hepatotoxicity. However, traditional animal models in vivo were not well adapted for the high-throughput screening in drug discovery, due to the shortcomings of time consuming, operation complexity and high cost. Recently, various drug metabolic models in vitro were invented. In routine drug research, primary hepatocytes cultured in 96-well plat