人泛素偶联酶UBE2CUbcH10基因的克隆、原核表达载体的构建及表达.pdfVIP

Medical 广东医学2009年5月第30卷第5期GuangdongJournalMay2009，V01．30。No．5 ·698· C／UbcHl 人泛素偶联酶UBE2 0基因的克隆、 原核表达载体的构建及表达水 杜红延，马奎，黄湘，王穗海，李明△ 南方医科大学生物技术学院抗体工程研究所(广州510515) 【摘要】 目的获取泛素偶联酶家族成员之一的UBE2C／UbcHl0的基因，构建具有His标签的原核表达栽 基因。克隆到pMD一19T载体中并测序鉴定，酶切回收后插入原核表达栽体pET32a(+)中，构建重组表达载体 重组表达载体pET32a—UbcHIO在大肠杆菌 pET32a—UbcHl0．转化大肠杆菌BL21，经IPTG诱导表达。结果 BL21中经IPTG诱导4h获得稳定高效的融合表达。重组蛋白以可溶形式存在，大小在29．0kD左右。结论 UbcHl0重组表达载体的成功构建以及重组蛋白的表达，为进一步其结构和功能的研究奠定了基础，有望揭示该 蛋白在癌症发生发展过程中的作用。 【关键词】 泛素偶联酶；原核表达载体；构建；表达 泛素一蛋白酶体途径(ubiquitinproteasomepath— 1．2 方法 1．2．1UBE2C／UbcHl0基因的获取收集肝癌细胞 way．UPP)是细胞内蛋白质降解的主要途径之一，细胞 内短寿命蛋白和一些异常蛋白的降解常通过该途径。 一般来说蛋白质通过该途径的降解需要泛素和4种酶 en— 家族的参与，即：泛素活化酶(ubiquitin—activating min，42℃60 条件：70℃5 min，70℃10min，冰上冷却。 ell- zymes，E18)、泛素偶联酶(ubiquitin—eonjugating zymes，E2s)也称泛素载体蛋白(ubiquitin—carrierpro— UbcHl0基因，设计PCR扩增引物序列如下：上游引 tein)、泛素连接酶(ubiquitin—ligatingenzymes，E3s)和 37引入 蛋白酶体(proteasome)…。其中泛素偶联酶UBE2C，EcoR 别名UbcHIO是参与细胞有丝分裂蛋白降解的泛素偶 TAGGGCTCCTGGCTGG 3’引入XhoI酶切位点。反应 联酶家族成员之一，该酶是细胞周期进展和周期蛋白 体系50斗L，反应条件：94℃预变性3min，以94。C变性 降解所必需的旧J。近年来许多研究均表明UBE2C／ 30 s，58℃退火308，72℃延伸458，30个循环后，再于 UbcHl0与肿瘤的发生、瘤细胞的恶性转化、增殖及其 72℃延伸5min。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳进行鉴 诊断、治疗相关。5o，有望成为人们日益关注的肿瘤潜 定，目的片段切胶用DNA回收试剂盒回收纯化。 在诊断和治疗靶标之一。然而，UBE2C／UbeHIO在肿 瘤发生发展过程中的具体作用还有待进一步研究。本 研究从人肝癌细胞中获取了UBE2C／UbcHl0基因，构 建该蛋白重组表达载体并在大肠杆菌中成功表达了该 蛋白，为该蛋白单克隆抗体的制备及后续在肿瘤发生 一T／UbcHl0载体中的目的片段用内切酶EcoRI和 发展过程中结构和功能的研究奠定了