基因工程lecture5 DNA cloning.pptVIP

第十章 目的基因的获得 Genetic Engineering Dr. Zheng Xuesong Shanghai Institute of Technology 5.1 Strategy and protocols for DNA Cloning 基因克隆 基因克隆又称DNA克隆，其中的一项关键技术是重组DNA技术。 重组DNA是用酶学方法，将不同来源的DNA分子在体外进行特异切割、重新连接，组装成一个新的杂合DNA分子。在此基础上，这个杂合分子能够在一定的宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子，此过程称基因克隆。 基因克隆的技术路线 ①分离制备待克隆的外源DNA片段 ②将靶DNA片段与载体连接，组装成重组DNA分子(recombinant DNA) ③重组DNA分子转入宿主细胞 ④筛选重组子 ⑤重组子的扩增和目的基因的分析 5.2 目的基因的来源 把DNA分子切割或连接成易于与载体连接的片段。 单酶切和多酶切； 完全酶切和部分酶切； DNA片段的回收。 5.4 DNA片段的体外重组 5.4.2 同源粘性末端间的连接 同尾酶连接时的“焊死”现象。 5.4.2 同源粘性末端间的连接 粘端连接需要避免的2个情况： 自身环化和两向连接。 解决办法： 定向克隆和酶切分析 同一种内切酶生产的粘性末端的连接 5.4.3 平端连接 平头末段连接的特点 平头末端连接的问题 5.4.4定向克隆的技术路线 质粒载体用BamH I和Hind III消化-〉产生BamH I和HindⅢ的粘性末端-〉与BamH I和Hind III所切出末端相匹配的外源DNA片段相连接 外源基因只能以一个方向连接于载体中：外源DNA片段的两端位点不同，线性DNA(载体或外源DNA片段)的两个非互补粘端自身环化的几率显然会大大降低。 5.4.5 DNA末端的修饰改造 1.粘性末端修饰成平头末端后连接 5.4.5 DNA末端的修饰改造 2. 同聚物加尾连接 在末端转移酶(terminal transferase)的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。 3. 人工接头(linker)连接 由平端加上新的酶切位点，再用限制酶切除产生粘性末端，而进行粘端连接。 人工合成的、含有限制性内切酶识别序列的、短的双链DNA片段。 4. DNA插口技术(adaptor)：人工合成的、具有粘性末端寡聚核苷酸。 5.5 重组DNA分子转入受体细胞 ● 受体细胞(receptor cell) 又称为宿主细胞或寄主细胞(host cell)等，从实验技术上讲是能摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞;从实验目的上讲是有应用价值和理论研究价值的细胞。 ● 感受态(competence) 细胞处于能够吸收DNA的状态，称为感受态。 ● 感受态细胞(competence cell) 处于能够吸收DNA状态的细胞。 选择受体细胞的基本原则 ①便于重组DNA分子的导入。 ②便于重组体的筛选。根据所用的表达载体所含的选择性标记与受体细胞基因是否相匹配，从而易于对重组体进行筛选。 ③遗传稳定性高，易于进行扩大培养或易于进行高密度发酵而不影响外源基因的表达效率。对动物细胞而言，所选用的受体细胞具有对培养的适应性强，可以进行贴壁或悬浮培养，可以在无血清培养基中进行培养。 ④受体细胞内内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低，利于外源蛋白表达产物在细胞内积累，可促进外源基因高效分泌表达。 ⑤安全性高，无致病性，不会对外界环境造成生物污染。一般选用致病缺陷型的细胞或营养缺陷型细胞作为受体细胞。 ⑥能使重组DNA分子稳定存在于细胞中。从受体细胞的角度出发，通常的做法是是对其作适当的修饰改造，如选用某些限制性核酸内切酶缺陷型的受体细胞就可以避免其对重组DNA分子的降解破坏作用。 ● 转化(transformation):指将质粒DNA或以它为载体构建的重组质粒导入细菌中的过程。 ● 转染(transfection):指病毒及其重组子导入受体细胞的过程. ● 转导(transduction):指噬菌体及其重组子导入受体细胞的过程 5.5 重组DNA分子转入受体细胞 （1）转化 转化(transformation)指质粒DNA导入细菌的过程。 在体外连接组装而成的DNA重组分子只能转入合适的受体细胞，才能大量地进行复制、增殖和表达。其转入方式随载体的不同而不同。 化学法转化 （CaCl2法） 于1972年由Cohen等人首创。 基本原理： ①感受态制备：使细菌处于0℃、二价阳离子(如Ca2+、Mg2+等)低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，处于感受态； ②转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面 ③经42℃短时