胸腺嘧啶啶核苷双阻断法同步化Ｖｅｒｏ细胞研究.pdf

胸腺喻健核昔双阻断法同步化Vero细胞， 高红亮 邪文波 丛 威， 欧阳藩 (中国科学院化工冶金研究所生化工程国家重点实验室 北京 10008田 摘要 本文研究了胸膝啥吮核普 (TdR)AR.阻断法同步化 Vero细胞的最适条件.结果表明， 在对数生长前期的细胞，用2ml的TdR队断细胞生长llh，然后恢复生长14h,2ml的TdR再阻断 11h.Vero细胞得到的同步化程度录高，同步化指欲 (51)为65.04%. 关甘词 Vero细胞 01步化 胸腺啥咬核等 (TdR)sot阻断法 1引言 动物细胞的大规模培养已广泛地应用于生物医药制品的生产[(1,21。许多研究者对动物细胞进 行了多方面的研究。为了深入研究细胞周期各时相中发生的变化，需要分别对细胞周期的不同 时相进行生化分析、形态或其 学的研究.和果用单个细胞为对象研究在许多情况下不仅 析，因此要在细胞群中利用人为的方法使细胞同步生长， 技术困难而且数量太少难以进行4rit+lk#j5q} 获得时相均一的细胞集团。动物 胞同步化主要事物理、化学方法或多种方法联合使用3,4〔1。化 学方法可以获得较商的同步率和 获率，但副作用大[(31然而使用过盆的脚腺哈吮核昔MR) 只是暂时性的减慢DNA的合成，印 果怡当的选择.TdR的浓度。当细胞去除TdR的影响时，细胞 袖 叩 能够正常生长、繁殖和传代，说 TdR对细胞的正常生理代谢产生的千扰是可逆的{(41。为此本 文研究了胸腺啥吮核着 (TdR)双粗断法同步化姆依赖性细胞Vero细胞的最优条件. 2材料与方法 2.1材料 2.1.1细胞 Ver。细胞，由卫生部北京生物制品研究所提供。 2.1.2培养基 199培养基(GI呻产品)，配制犷每升加2gD-有萄墉和2gNaHC031·用时再加 10%/J、牛血清(天津市川页生化制品有限公司产品)。 2.2方法 2.2.1细胞培养 细胞于25m1方衣中37℃恒温培养，接种密度为0.7XIOsceIis/ml 2.2.2细胞计数 细胞经2%Af酶消化后，血球计数板计数(21 2.2.3Giemsa染色 倒掉方瓶中的培养液，加入适量固定液[2]，固定30min,蒸馏水冲洗后， 加入Giemsa染液[21染色30-40min. 2.2.4分裂指数 (MitoticIndex,`Ill)侧定 将Giemsa染色后的样品置于显微镜下，选择细 胞密度适中的区域用400倍镜头观察分裂细胞，计数每1000个细胞中处于分裂相的细胞的平均 值和所占百分比。 ，国家自然科学基金 (和中科院多相反应研究开放实验室基金资助项目。 2通讯联系人。 65# 2.2.5同步化指数 (SynchronousIndex,SI)的计算 采用Scherbaum}〕根据生长时间和细胞 数的关系求出S1，如图1所示。其Si值的计算公式为: [n 、‘1,、 J1=}一 一1111一士二} tno )l 了:) no为初始时细胞密度，刀为增殖一代后 稳定后的细胞密度，td为细胞分裂开始至分 裂结束的时间间隔 (实验测得)，R为实验测 得的代时。 3结果与分析 3.1Ver。细胞生长曲线 在25m1的方瓶中Ver。细胞的生长曲线 如图2所示细胞接种密度0.7xlOcellls/ml, 图 1Growthcurveofcell 最高密度为4.77xlOcells/ml·细料的对数 生长期为第24-96h。对数期Vero 增时间T为.18.5h。一般认为TdR; 步化法加入换入TdR溶液的最适时 胞 :时间t}} 群体的对数生长初期[[2,53。本实 TdR溶液的时问为48h. VA本Td 3.2Vero细胞同步化最适 文献中用TdR双阻断法 物细胞时一般采用2m