PCR技术与Bt+ICP基因的鉴定.pdfVIP

181_、下价 植物保护2!世纪展Yn 飞 。〔平;2 PCR技术与BtICP基因的鉴定 弘袖 杰 宋福平 (中国农业科学院植物保护研究所、植物病虫害生物学国家重点实验室 北京 100094) 摘 要 本文从介绍t要的杀虫微生物一 s的101基V!研究现状人手，结合BtcYA因分离 克隆的进展，重点介绍了近年来具有较人影响的10种PCR鉴定方法，并加以分析、比较，提出 了适合我国国情的研究方法和思路。 关键词 Btcr,Alk7 PCR M因鉴定 莎亘垫董夔Y,扛菌.(Bacillusthuringiensis,简称Bt)能产生具有强烈杀虫作用的晶体蛋白 (insecticidalcrystalprotein,ICP)，对鳞翅目、鞘翅目、双翅目、同翅目、膜翅 目等节肢动物，以及动植物线虫、蟀蜻等都具有特异性的毒杀活性，而对非目标生物安全。 半个世纪以来己广泛应用于全球的多种农业和林业害虫的生物防治。1981年Schnepf克隆 了第一个杀鳞翅目害虫的Bt杀虫蛋白基因，从此，分离克隆新的1CP基因成为国际上Bt 研究新的热点。为了在研究、开发和应用等方面领先，目前各国都在竞相寻找对新的害虫 有活性的Bt菌株及相关的特异性新基因，如对线虫 蚂蚁、虱具有活性的新的Bt菌株或 杀虫蛋白基因，近年相继发现和分离。 从Bt菌株中克隆新基因，首先要确定菌株中所含有的基因类型。80年代初期的方法 只能是先克隆基因，再通过活性分析和序列测定来确定。尽管后来使用了Southern杂交、 酶联免疫、杀虫生测等方法进行Bt基因的鉴定，仍然耗时、费力，十分烦琐。PCR技术以 其快捷、灵敏、准确等特点已j一泛地应用于生物、医学等领域，近年来被尝试用于Bt菌 株的基因鉴定，并已在实践中取得了巨大的成功。1989年，116fto和Nhito1ey在以杀虫 活性和氨基酸的同源性的基因分类系统中已收录了 12种cry基因;6年后，Crickmore根 据ICP氨基酸序列的同源性进行分类的新系统中公布的二Y基因已有94种。而1990^1998 年，仅3年的时问，分离克隆的新Bt基因多达44仲。取得如此快速进展的重要原因应当 归功于PCR技术的应用。 1 研究进展 1991年，美国C1BA一Geigy生物技术研究所的】.B.Carozzi首次将PCR技术用于Bt 基因的鉴定和杀虫活性预测。他根据当时己公布的基因序列设计了伦条特异性引物，用 于鉴定旧分类系统的 ry‘1A(a)、cry1A(b)、cryJA(c)、cry111A,cry111B,cry1DA,crylVB, 并根据鉴定的基因型对菌株杀虫活性进行预测。预测结果与实际生测结果相符。 1993年，PCR技术用于Bt基因的鉴定在国外不同的实验室都取得很大进展，并在研 究方法上有所突破。日本北海道大学的浅野真一郎根据 cryl7基因的保守区设计了寡核普 酸弓}物，PCR扩增之后，用限制性内切酶消化扩增产物，根据酶切片段长度差异，即可鉴 定cryllA,cry11B基因 汾 闷 a.!`M:d 张杰等:PCR技术与BtICP井闪的鉴定 同年，加拿大国家生物技术研究所的R.Brous、二建立了一种新方法:Arbitrary PrimerPCR,(AP一PCR)，即RAPD。他们设计i一套随机公}物，。个核昔酸长，共120条， 用于鉴定已商品化的Bt菌株。含有已知基因的Bt菌株PCR扩增产物的分布范围是从250^- 1500bp，依此作为判断的标准。 而新西兰园艺食品研究所A.P.Gleave等工作更有意义，他们设计了cryv基因的特异 性引物，用于。ylr基因的51部分。分析了21种Bt心 型菌株，他们发现其中7种含有。-yV 基因，并从kursiaki亚种DSIR732中克隆了一种对鳞翅目和鞘翅目均有活性