鸡胚成纤维细胞cDNA文库的构建.pdfVIP

鸡胚成纤维细胞cDNA文库的构建 刘 2 王笑梅1 伟L 高玉龙1 高宏雷1 1．中圆农业科学院哈尔滨兽医研究所，兽医生物技术国家重点实验室，禽传染病研究室， 罴龙江睁尔滨。150001 2．东北农业大学，黑龙江哈尔滨，150030 关键溺 待索性法氏囊病痛毒(1BDV)鸡胚成纤堆细胞cDNA文库克隆技术 适应鸡的B淋巴细胞。但其可通过鸡胚传代的方洼致弱．超强毒株的致弱与细胞嗜性的改变是相传而 生的，致弱后的毒株可l：上糕CEF细胞上增殖．我们实验窒已将wlBDVGx株经过在鸦胍上传5代、 eEF上传20代获褥糨应的致弱疫菌株Gt株[”． 璃胚成纤维细胞是实验常用的细胞原料之一，也是研究鸩传染性发法氏囊病毒的主要细胞材料。 胚成纤维细胞的cDNA文席。弗在库细胞的选择、构建方法和载体选择上都具有独特之处，尤其是运用 段的cDNA．为研究鸡传染性法氏囊病毒在鸡胚成纤维细胞中的病毒受体厦其细胞嗜性提供了理论物 质基础，同时也为其他适应于鸡胚成纤维细胞上生长的病毒提供可靠的实验基础． 一、材料与方法 (一)材料 1．鸡臁 实验所用SI下鸡胚由中国农科院埝尔淡兽医研究所实验动物中心提供． 2．细胞培养液 索、链霉寨双抗溶液，上述溶液均经过滁蔚过滤或灭菌。检验无蔼后冷冻或常温像存备用． 3．载体与引物 载体p ·39‘ 4．主要试剂 2．O CoI— TRI∞I“总RNA程取试剂、FastTnnkmRNA纯化试荆盒和cDNA I限制性内切酶购自纽荚伦生物技术有限公司． u蛐s均购自美国In、，itrogen公司}BsrG (二)方法 1．鸡胚成纤维细胞的翩备 胞。分装至细胞瓶．37℃培养待用． 2．细胞总RNA的提取和mRNA的纯化 操作．提取的细胞总RNA和纯化的mRNA经分光光度计检测检溅吸光度辰用于构建文库． 3．cDNA第一链的会戚 将3邸mRNA溶于DEPC承至9pl，加入l弘IBioti聃ttB2—o“go(dT)引协、1严l 5min。冷却到45℃后加入4肛l5×第一链Buffer、2pIO．1M弧T、1肛l SSⅢRT45℃60两n合成cDNA第一链。 4．cDNA第二链的宝成 dNTPMix 3一。16℃下，2h，合成第二链． (2t∥f11)1一。10mmol／L S．连接量“Bl T4 O．5M adapt日将合成的第二链cDNA加人2弘l E阱A 600pl 重悬沉淀．在沉淀中加人attBladapter Buffer DNA 10肛I，5×Adapter10肛1．0．1MD竹7pl，T4 5“1．16℃作用24h。 6．过柱纯化 连上attBl (PSA)来估算cDNA的产量． 7．完成c删A文库的构建 将台成的cDNA连入pD()NR”221载体，电转化刭感受态细胞，究成建库． 8．cDNA文库的鉴定 随机挑选23个克隆甩BsrGI进行酶切，l％琼脂糖凝胶电泳分析撼入片段． 9．序列溅定及分析 随机挑选9个克廉进行序列测定． 二、结果与分析 (一)提取的鸡胚成纤维细胞总RNA的质量分析 ·40· Az∞／A。*分别为L93和1．96说明纯度较高。 瞰l鹏胚戚纤维细胞总RNA电泳嘲 嘲2鸡胚成