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3T3细胞毒检测方法预测物质的刺激性 Detectionof3T3cells toestimate oftestmaterials toxicity irritancy 杨奕敏黄晓青郑赛华林惠芬 Saihua,LinHuifen YangYimin，HuangXiaoqing，Zhen 上海家化联合股份有限公司上海200082 JahwaUnited 200082 Shanghai Co．Ltd，Shanghai 摘要：本文利用3T3细胞建立四唑盐比色试验(MTT法)，检测对细胞的毒性作用来预测化妆品产品配 方或原料物质对皮肤的刺激作用。3T3细胞与受试物质共培养24小时后，检测细胞由于损伤而对显色 剂四唑盐的吸收量减少。本文选择不同物质检测对细胞的毒性，结果表明MTF法作为一种产品或原料 的安全性预测或筛选方法或指标，具有简便、灵敏、重复性和经济等优点。 MTT WasestablishedtodetecttoxiceffectsOil3T3cellandestimateskin ofthe Abstract：The assay irritancy testmaterials。A危盱24hofculture。thereductionin oftheMTrof3T3cells thetest uptake injuredby materialswasmeasured． 关键词：3T3细胞，四唑盐比色试验(MI．r法) words：3T3 Cells，MIT Key Assay 一、前言 安全性评价在化妆品产品研究与开发中相当重要，原因是皮肤敏感者人数不断在增长，消费者对产 品的安全性需求越来越高，而功能性产品本身的功能性与安全性是一对矛盾。因此，研究产品安全性的 评价方法，尤其是体外方法包括细胞培养技术的应用，是目前化妆品行业的趋势。细胞培养技术及其方 法应用，优点在于实验周期较短、检测终点明确，以及可以了解物质毒性的作用机制(对细胞的直接毒 作用或影响代谢作用等)。本文的细胞毒实验采用四唑盐比色试验(MTT检测法)。 四唑盐比色试验是一种检测细胞存活和生长的方法。显色剂四唑盐是一种能接受氢原子的染料，商 品名是噻唑蓝，简称MIT。活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTr还原为难溶性的蓝紫色结 晶物质并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜(DMSO)能够溶解细胞中的紫色结晶物质， 用酶联免疫检测仪测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成 的量与细胞数成正比。 二、材料 MTr溶液(Sigma公司，使用液浓度5mg／m1) 二甲基亚砜(DMSO)：使用分析纯产品 0．25％胰蛋白酶 其他物品：可调移液管、吸管、离心管、计数板、C02孵育箱、显微镜、振荡混合仪、酶联免疫检 测仪 三、实验步骤 1、细胞接种：用0．25％胰蛋白酶消化单层培养细胞，待细胞完全从壁上脱落，加入培养液适量终 止。反复吹打，用培养液配成单个细胞悬液，以每孔103～10个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积 200Ill。 时。 3、 细胞染毒：将96孔培养板中的培养液吸去。在第一排和最后一排中加入培养液，分别代表未 染毒对照组和空白对照组。将受试物质按试验要求配制成不同浓度，从第二排起，依次加入含有受试物 322 质的培养液，每孔体积200ttl。放入C02孵育箱，继续培养24小时。 C02孵育箱继续孵育。3h后终止培养。小心吸弃孔内培养上清液(吸去培养液时，动作要慢，以免吸去 结晶物质)。每孔加入150ulDMSO振荡10min，使结晶物充分溶解。 5、 比色测定：选择570nm波长，并以空