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适于核桃的RAPDPCR反应体系的建立 59 适于核桃的RAPD-POR反应体系的建立 张虎平1牛建新1王国安2虎海防2马兵钢1朱军 (1新疆石河子大学农学院园艺系，石河子832003：2新疆林业科学院，乌鲁木齐832000) L)特异性状的相关基田进行分子标记研究，采用CTAB 摘要：为了对核桃(Juglansregia 法和改进的CTAB法，从叶片中提取核桃基因组DNA，比较其分离效果。结果表明，改进的 CTAB法可有效去除细胞内多糖和多酚等杂质对模板DNA的污染。并以此为模板进行RAPD 反应，对RAPD反应程序中的一些重要参数进行摸索和优化试验，建立适合于核桃的 RAPD-PCR反应体系，以进行该树种的分予标记研究。 关键词：核桃：DNA提取；RAPD L．)栽培历史悠久，在长期的进化与栽培过程中表现出了特有的 核桃(aruglansregia 优良性状．如早实特性(石荫坪等，1999：奚声珂，1987)和孤雌生殖特性，蕴藏着许多非 常宝贵的控制优良性状的基因资源。对核桃特异性状的基因进行分子标记，不仅为今后核桃 种质资源的开发研究提供一定的理论依据和实践基础．而且借助基因分离和克隆技术可用于 作物的品种改良。 DNA，随机扩增多 20世纪90年代后发展起来的RAPD(RandomAmplifiedPolymorphic 态性DNA)技术简单易行，可快速寻找两组DNA样品问多态性差异，进而得到与此差异区域 相连锁的DNA标记，这样利用RAPD即可定位在某一特定DNA区域内的特定基因…。但RAPD 反应体系中各组分的浓度、DNA扩增中各步骤的温度和时间等，均会直接影响扩增效果”1。 因此，DNA的提取和PCR扩增条件的优化和可靠性，是对任何一个物种进行RAPD研究必须首 先解决的关键问题。本文研究了用于核桃RAPD—PCR实验所需ON的提取方法和PCR最优化 反应体系的建立，为其后的研究做必要的准备。 l材料与方法 1．1试验材料 供试材料由新疆林业科学院提供，叶片于10月中旬分别采自6个表型不同的植株，带 回实验室后置一70C冰箱中备用。 1 2 DNA提取方法 1．2．1 CTAB法各样品称取0．19，去除叶脉后参照既有的研究结果”’”提取DNA。取DNA 原液20 1．2．2改进CTAB法为克服多糖和多酚等对DNA质量的影响，本研究参考一些研究文 基金项目：新疆自然科学基金资助项目(211003) 160 干果研究进展(3) 1 迅速研磨至粉末，将冻粉迅速转入预冷的1．5ml离心管中，加入50B一巯基乙醇(BME)， 5min。弃去上清夜，加入700 出加入700 1．5m]离心管中，加入1／5V5MNaCl后混匀，然后加入2／3V异丙醇，静置使DNA沉淀。室温 1TE和200 离心弃上清液后(可用适量70％乙醇洗2次)加入400 15MNaCl使沉淀溶解，加 入RNaseA(10g／m1)，37℃水浴30min后加入等体积的苯酚一氯仿(1：1)和氯仿各抽提一次。 洗2～3次，室温干燥后溶于501TE(10mMTds．CI，0．1mMEDTA)，一20℃保存。 1．3 RAPD扩增反应 KCl，100mM dNTP pH9．0，25℃Tris．Cl，1．0％TritonX-100)2．59l，25mMMg“3．59l，2．5mM EB的1．5％琼脂 1．3．2取25¨lPCR扩增产物与1山Loadingbuffer混匀，点入含有O．5pg／ml 糖凝胶中，在3V／cm电场强度下电泳4h，于紫外检测仪上观察并用Kodak数码相机照相记 录。 2结果与分