藤黄灰链霉菌中抗生素AGPM生物合成途径的初步研究.pdfVIP

藤黄灰链霉菌中抗生素AGPM生物合成途径的初步研究 陈贵斌 牛晋阳 张建勇 元英进 胡宗定 (天津大学化工学院制药工程系，天津300072) 摘要 本丈利用刹激实脸法、静忠细胞培养法以及阵抑制刑应用法对藤黄灰健耳蔺中杭生常AGPM生 物合成途径进行了初步探讨。研究表明能转化成聚阴合成所常活性前体的孰基睦如异亮氛酸、晰氛 酸、蛋氛酸、谷氮酸等以及姐健脂肪酸中乙胶、丙故、丁故对杭生素AGPM合成具有明显利激作用; 另外，在培养基中添加脂肪酸和聚阴生物合成透径的专一性抑制荆浅蓝菌素 (25pg/m1),脂肪改合成 抑制荆块代乙耽按 (0.5.M)时，蔺体生长不受影响，而杭生素AGPM产1受到级烈抑制，分别为对 照的35.3%和26.2%;当块代乙跳胺的浓度增加至1mM时，杭生素AGPM的生物合成几乎完全受抑 制。因此。根据以上实脸结果初步推断杭生素AGPM是由录明边径合成 #ow 4*e成渔径 扰生素AGPM 轰阴途径 落黄灰桩霉菌 长期以来，改造抗生素生物合成途径使抗生素高产或得到效价更高的新抗生素一直是人们 所追求的目标。但由于缺乏抗生素生物合成以及其调控机制的知识，抗生素菌种的改良只能借 助于传统诱变和筛选方法。自从20世纪80年代，随着链霉菌、曲碌、青碌等抗生素产生菌DNA 重组技术发展，利用基因工程技术对抗生素生物合成途径进行改造成为可能HI。这就要求人们对 各种抗生素生物合成过程中限速步骤、关键酶、以及它们与基因的对应关系有详细深人的了解， 才能用基因操作方法进行生物合成的控制。另外，随着抗生素的大量使用，人们也面临病原菌 抗药性这一重大问题。解决这问题方法之一就是根据人们对抗生素生物合成机理的认识，利用 基因工程技术得到杂合抗生素;2,3)或利用生物转化和有机化学合成方法改造已有抗生素以达到新 的治疗效果。因此，抗生素，尤其新型抗生素 (先导化合物)的生物合成途径研究对进一步提 高抗生素产率和新药开发具有重大意义。 抗生素APGM是由新发现的藤黄灰链霉菌 (S.Luteogise。二;，)产生的一种新型抗生素，对 小麦赤霉病、黄瓜炭疽等17种由真菌引起的植物病害有很好的防治作用。另外，体外实验研究 结果表明其对非小细胞肺癌、白血病抑制作用比紫杉醇、多烯紫杉醇效果高10-100倍，具有良 好的应用开发前景和研究价值[[a)。根据初步推断，抗生素AGPM的结构式如图1所示，从其结构 上可以看出与大环内酪类抗生素有相似之处，但由于含有许多杂环，因而其生物合成途径可能 更加复杂。本文拟通过各种氨基酸和短链脂肪酸对抗生素AGPM的刺激试验、静止细胞培养 (restingcellsystem)试验和添加酶抑制剂等方法，初步推断其生物合成途径，为下一步用同位素 示踪法标记前体和诱变筛选阻断突变株研究其在藤黄灰链霉菌中的生物合成途径与代谢调控机 制打下良好的基础。 1材料与方法 1.1菌株:藤黄灰链霉菌 (Stmptomycesluteogriseusvar.)为本实验室从土壤中筛选分离得到，经 中国科学院微生物研究所鉴定。 1.2 培养基:用于培养藤黄灰链霉菌的固体斜面培养基、液体种子培养基和发酵培养基均按文 献 4〔]配制。而静态培养则采用按文献 5【」略加改变的培养液 (以L):葡萄糖，5g; MgS4.7H,O,1g;KH2PO,，1g;NaCl,ig;O.lmol吗琳基丙磺酸。 1.3培养方法:斜面种子培养和液体种子培养参见文献 [4]。在氨基酸和短链脂肪酸刺激试验 中以10% (V/V)的接种量将液体种子接人装有50mL发酵培养基的250mL摇瓶中培养4天;静 止细胞实验则在培养2天后离心收集菌体 (5000rlmin,l0min)，再用无菌水洗涤3次后悬浮在培 158 养液中 (浓度为log湿菌体几培养液)，然后加人各种氨基酸或短链脂肪酸培养1天。添加酶抑 制剂的试验则在装有15.,1发酵培养基的100mL摇瓶中进行.从。小时起每天添加终浓度为25pg1 nli的聚酮合成酶 (PKS)抑制剂浅蓝菌素 (cemlenin)或者碘乙酞胺，连续培养5天。 1.4 抗生素效价测定方法: 根据中国药典用杯碟法Isl测定。取50川离心后的发酵液f清液置于牛津杯中。37`C培养18 小H士;后侧定抑菌圈直径，与标准曲线 (T二1.0931x100,R=0.99956,SD二0.02187,7.5D ‘23)对照得到相应活性 (每个样品重复三次)。AGPM活性单位定义