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Pierce生物技术在蛋白质组学中的应用 PIERCE Technical Focus: 有机合成，化学偶联，表面化学和分析化学 Product Focus： 分子生物学：各种化学发光Blotting,EMSA,RPA, 蛋白质组学：蛋白抽提, 蛋白定量,纯化,样品制备，功能研究以及各种染色试剂和预染Markers 免疫学 ：抗体制备,纯化，片断化,分型和修饰 交联化学：cross-linker，生物素化试剂……等分子标记试剂 Pierce生物技术在分子生物学和蛋白质组学中的应用内容包括 以下三个方面： 1.Western Blotting的问题与对策 2.蛋白质提取,染色和定量 3.蛋白质样品制备之高效透析，一步脱盐，超级浓缩及RED 1.Western Blotting的问题与对策 Western Blotting方法选择 检测系统比较 检测方法 影响Western blotting成功的要素 常见问题分析与对策 Western Blotting方法一 直接法： 优点： 1.快速（一种抗体） 2.没有二抗交叉反应引起的非 特异性条带 缺点： 1.免疫反应性降低 2.无信号二级放大 3.抗体标记费时昂贵,使用不方便 两种检测酶系统的比较 HRP（辣根过氧化酶) AP（碱性磷酸酶） 大小 40Kd 140Kd 最佳酶活性 PH：5－7 PH：8－10 酶活和二抗特异性 好于AP 抑制剂 氰化物， 硫化物 叠氮钠 氰化物， 砷酸盐，有机磷， 二价阳离子螯合剂 稳定性 零度以下稳定 零度以下不稳定 底物 很多 部分 动力学特性 快速 慢 价格 便宜 昂贵 检测方法及特点 化学发光法: 灵敏、快速、高效、无害、特异性高 化学显色法: 方便、有毒、灵敏度较低、不易保存 同位素法 : 灵敏度高、不安全、 环境污染、不方便和半衰期短 荧光底物法 影响Western blotting成功的要素 蛋白抽提/样品制备/电泳 膜的选择和转膜 封闭液的选择和封闭条件的优化 一抗和二抗的选择以及稀释倍数的优化 “通用”二抗 合适的底物：发光或显色底物 曝光时间的掌控 X- 光片,信号增强剂 Striping 抗体剥离buffer Eraser it底片背景去除剂 封闭液的选择和封闭条件的优化 封闭液的选择 1、无生物素，无血清蛋白 2、无交叉反应 3、1－15分钟封闭时间 4、10－20：1的信噪比 封闭条件的优化 1、时间 2、温度 3、去污剂 底物的选择： 灵敏度，经济，方便与否 发光底物：HRP 和AP底物系统: 显色底物：HRP 和 AP底物系统: 底片和曝光－成败的最后关头 底物与膜孵育 X- 光片 曝光时间的掌握 显影和定影液 信号增强剂 抗体剥离缓冲液 底片背景去除剂 常见问题 比较均一的高背景 斑点、发泡式或闪烁式的高背景 信号弱或者无信号 非特异性条带 弥散型条带 白色条带、黑点或信号下降太快 （一）Poppers蛋白质提取—细胞, 组织裂解和蛋白提取的一场革命 传统的细胞裂解方法：①机械法，容易引起蛋白质变性和聚集②匀浆破碎法，需要低温进行③研磨法 蛋白回收率低④超声破碎法，需要额外设备⑤反复冻融法。 Poppers：基于 Pierce专有技术用于细胞裂解和核酸、蛋白抽提的高效方法，主要有以下几种： B-PER?, T-PER?, M-PER?, Y-PER,I-PER，P-PER 1. M-PER?培养细胞总蛋白提取试剂 无须刮擦收集细胞，温和裂解细胞和溶解蛋白 适合high-throughput细胞裂解（24，96 well) 适用范围广 非变性剂裂解，与下游分析相容性好 蛋白收率高（25-20%via冻融法和超声法） 可透析 2.T-PER?动物组织总蛋白提取试剂 温和可透析:25mM N-二(羟乙基)甘氨酸, 150mMNaCI 相容性好：可加入蛋白酶抑制剂、螯合剂、还原剂和盐 可用于各种下游分析 操作简单 样品:T-PER? 1:20(W/V) 加入裂解液，匀浆 10000rpm离心取上清 3.B-PER?细菌总蛋白提取试剂 非离子型去污剂，温和裂解 高效快速-10min 无须昂贵设备：离心分离 相容性好：能用于GST，His等亲和纯化 可加入蛋白酶抑制剂、螯合剂、还原剂和盐 可透析，便于