启动子调节缬氨酸代谢生产.pptVIP

;关键酶和编码基因;构建谷氨酸棒状杆菌L-缬氨酸生产菌株的多种基因操作方法：;乙酰辅酶A;策略;实验方法;二、ilvN, ilvD 和 ilvE转录起始位点的确定 ilvD的启动子相比较最弱（0.014±0.01U每毫克蛋白质),ilvE的启动子中等(0.18±0.02U每毫克蛋白质)，ilvN的启动子最强(0.6±0.09Umg protein-1)。 翻译起始密码子与转录起始位点的距离在ilvN ， ilvD ， ilvE中分别为377，120 ， 1bp。 所研究基因的转录起始位点是通过引物延伸分析确定的。 ;结果;四、 ilvD， ilvE ,ilvA 和leuA基因突变启动子的构建及鉴定 为了加强表达缬氨酸生物合成中的基因，我们诱变了ilvD和ilvE启动子的-10区域以增加启动子活性（启动子上调突变）。携带突变启动子的片段P- ilvD( 1184 bp）、P-ilvE（1108bp）与载体pKSAC45连接后分别导入到敲除了?P- ilvD或? P-ilvE基因的谷氨酸棒杆菌染色体上，此过程应用的是基因置换技术。筛选出缬氨酸及异亮氨酸营养缺陷型回复突变为原养型的克隆体。 将已验证的突变启动子片段亚克隆在pET2上，然后通过测定在完全培养基上培养后得到的细胞提取物中CAT报告基因的活性以测定启动子活性。（表5）筛选出突变启动子P- ilvDM14和P- ilvDM7 （比野生型 P - ilvD 高18和100倍）以及P- ilvEM6（ 比野生型P-ilvE 高22倍）进行进一步实验。 ;四、 ilvD， ilvE ,ilvA 和leuA基因突变启动子的构建及鉴定 含ilvA基因的谷氨酸棒杆菌在限定异亮氨酸的条件下生产L-缬氨酸。然而，营养缺陷型菌株的最低培养基条件必须补充L-异亮氨酸。此外，培养基中高浓度的L-缬氨酸强烈抑制细胞对L-异亮氨酸的吸收。因此，在营养缺陷型菌株生产L-缬氨酸的过程中不能保证L-异亮氨酸的充分吸收。 为了避免这种现象，我们决定构造一个异亮氨酸渗漏突变型的菌株，此菌株能较低且缓慢的合成异亮氨酸，但不需要补充异亮氨酸。出于此目的，构建弱化突变启动子P-ilvAM1CG和P- ilvAM1CTG的pKSAC45 （见表5）。突变启动子的活性（在克隆pET2 测试后）分别比野生型的 P- ilvA 低13和16倍（表5）。;四、 ilvD， ilvE ,ilvA 和leuA基因突变启动子的构建及鉴定 在谷氨酸棒杆菌ilvNM13△panB△ilvA中敲除的等位基因ilvA被含P-ilvAM1CG的完整ilvA基因所取代。正如预期的那样，由此产生的营养作用缓慢的谷氨酸棒杆菌ilvNM13 ?panB P-ilvAM1CG生长更加缓慢（与野生型菌株相比）。但是，不同于亲本ilvA菌株，在添加或者不添加L-异亮氨酸的基本培养基中得出了相同的生物量（ OD600 = 35 ）。 异亮氨酸渗漏突变型和营养缺陷型菌株指数时期的增长率和在培养基中含有2mM异亮氨酸（分别μ=0.116±0.025 和 0.118±0.020 h?1,） 时是相似的 ，但渗漏缺陷型菌株在限制条件下（没有异亮氨酸）比营养缺陷型在含0.4mM异亮氨酸（分别μ= 0.063±0.018 和0.087±0.022 h?1）条件下生长缓慢。 ;四、 ilvD， ilvE ,ilvA 和leuA基因突变启动子的构建及鉴定 类似的，通过构建携带突变型启动子P- leuAM3A， P - leuAM2C 和P - leuAM2TCG的亮氨酸渗漏缺陷型菌株，来比较异亮氨酸和亮氨酸匮乏的影响。突变体的P - lueA启动子活性比野生型P - leuA 低80-125倍（表5）。在谷氨酸棒杆菌的染色体上，野生型P - leuA被突变启动子所取代。所得菌株在所有条件下均为L-亮氨酸渗漏缺陷型，而且在基本培养基中生长受L-亮氨酸的限制。弱P- leuA菌株的生长速率与弱P-ilvA 的菌株差不多（ μ= 0.07A ±0.01 h-1 ）。 ;谷氨酸棒杆菌ilvNM13 ?panB P - ilvAM1CG比亲本的营养缺陷型菌株产生L-缬氨酸多10%;高效无质粒的缬氨酸生产菌株;Thank you