糖基化肽段库构建和高通量检索新方法.pdfVIP

V01．31 高等学校化学学报 No．10 CHEMICAL0FCHINESEUNIVERS兀1ES 1916～1918 2010年10月 JOURNAL [研究快报] 糖基化肽段库构建和高通量检索新方法 刘铭琪1”，张扬2，陈瑶函1’2，杨芄原1，2 (1．复旦大学化学系，上海200433；2．复旦大学生物医学研究院，上海200032) 关键词蛋白质组学；翻译后修饰；糖基化；串级质谱；搜库软件 中图分类号0657 文献标识码A 文章编号025l聊90(20lO)10-1916旬3 随着蛋白质组学的快速发展，蛋白质的翻译后修饰引起了广泛的关注．其中蛋白质的糖基化修饰 是最常见、最重要的蛋白质翻译后修饰之一，在许多生理和病理过程中起重要作用¨q]． 同时获得蛋白糖基化氨基酸位点和糖链结构信息，对了解糖基化的生物学意义重大HJ．但由于检 索软件的限制，尚未有高通量鉴定实际样品中完整糖肽组成的相关报道．目前，蛋白质组学中糖基化 研究的主要手段为：糖肽经富集后，使用特异性内切酶将糖链切除，再分别对糖基化位点和糖链的组 成进行研究‘5_7|． ． 本研究组发展了全新的高通量糖基化肽段检索新方法，并开发了检索软件GRIP．新的检索方法突 出了糖肽在CID碎裂时糖链发生连续丢失的特性，同时充分运用了来自糖基化研究中已有的成熟技术 所检测的位点及糖链信息，高通量地自动解析完整糖肽的串级质谱．我们检测了人血清样品中的糖 肽，在3次实验中一共鉴定得到4116张糖肽的串级谱图，对应198个N一糖基化位点，充分体现了糖基 化的微观不均一性．目前国际上关于血清糖肽谱图鉴定报道为62张谱图埔1；改进后的肼腙富集法鉴 定到了36个N一糖基化位点归1；本次鉴定结果的规模和质量均未见报道． 1实验部分 1．1 蛋白的还原烷基化 mmoL／L，于37℃振荡反应1h，使蛋白二硫键还原；然后再向该样品溶液中加入碘乙酰胺(Iodoacet． amide，IAA)，使其终浓度为30mmoL／L，于室温下避光振荡反应1h，使蛋白半胱氨酸烷基化． 1．2 mmoL／L 蛋白的酶解将经还原烷基化处理的蛋白样品用25 NH。HcO，稀释到合适体积，按胰蛋 白矽蛋白质量比1：50加入胰蛋白酶，于37℃振荡反应过夜．酶解样品经真空离心干燥后备用． 1．3 糖肽的亲水富集 亲水富集材料Sepharose 进行活化，然后以正丁醇／乙醇／水(4：1il，体积比)溶液润洗3次．将冻干的蛋白酶解样品溶解于正丁 醇／乙醇／水溶液中，加入经活化、润洗后的材料中，于室温振荡孵育lh．离心弃去上清液，材料经正 丁醇／乙醇／水溶液振荡洗涤3次，然后加入50％乙醇水溶液，于室温振荡洗脱30min，收集上清液(即 为粗分的糖肽组分)，真空离心干燥后备用． 1．4糖肽的去糖基化将糖肽组分溶解于25mmoL／L的NH。HcO，溶液中，按照约1mg样品加入 PNGase 1恤L F(NEB)的比例加入糖苷酶，于37℃孵育过夜． xL(-I’}le姗。公司)仪器进行ESI质谱分析．将真空离心干燥的 1．5色谱．质谱鉴定使用uQ—Orbitrap 肽段溶解于含0．1％甲酸的5％乙腈溶液中．通过强阳离子交换柱(180斗m×2．4cm，waters公司)和 s． 强度前6位的母离子，动态排除30 1．6数据检索使用仪器自带软件对质谱仪所采集的文件进行串级谱图的提取，随后用Sequest软件 收稿日期：2010∞5粕． 基金项目：国家自然科学基金(批准号资助． No．10 刘铭琪等：糖基化肽段库构建和高通量检索新方法 1917 进行检索，搜库参数：母离子容差2×10一，子离子容差l，’咖sin半酶切，固定修饰为半胱氨酸烷基 卡值过滤，得分超过o．9的谱图为可信结果． 2结果与讨论 2．1 软件处理流程完成去糖基化样品的鉴定