紫花苜蓿MsCOL1基因RNAi表达载体的构建及转化.pdfVIP

第35卷第4期 中 国草地学报 2013年7月 V01．35NO．4 ChineseJournalofGrassland Jul．2013 文章编号：1673-5021(2013)04—0007-06 洪1’。 周光辉1’2，杨青川2，张铁军2，晁跃辉2，金 (1．内蒙古农业大学农学院，内蒙古呼和浩特010019；2．中国农业科学院畜牧兽医研究所，北京100193) 特异性引物，以紫花苜蓿cDNA为模板，分别合成用于构建干扰载体的正反义片段，将正反义片段分别插入表达载 紫花苜蓿中。经PCR检测，获得了7株转基因植株。经RT—PCR检测，证明转基因植株中MsCOLl基因表达量有所 下降，其中5株的表达量明显的降低。结果表明，已构建成功具有发夹结构的RNAi载体pART-孓A，它可有效的抑 制紫花苜蓿Msc0L1基因。 关键词：紫花苜蓿；RNAi；转基因；MsCOLl 中图分类号：$541 文献标识码：A 对于植物来说，开花是其在生长发育中非常重 1材料与方法 要的阶段，具有极其复杂的调控过程和机制。研究 1．1实验材料 表明，CONSTANS(CO)基因在长光照引起的开花 中起核心作用，编码一个含有锌指的核定位蛋 1．1．1 菌株与质粒 DH5q 白[卜23；CO基因mRNA的丰度受时钟节律调控，当菌株与质粒大肠杆菌感受态菌株E．coli 植物在长光照生长条件时，CO在光照后期积累[3]，购自北京康为生物科技有限公司；克隆载体pMDl9一 在这种条件下，C0作为一种转录因子，能够激活 Plant 和pART27从澳大利亚CSIROIndustry获得； FT基因[4~6]和SOCl基因[7]的转录，从而促进开 花。在拟南芥中，CO基因的突变体导致开花推迟， 过量表达Co基因。可以提高FT基因表达，导致提京畜牧兽医研究所保存。 前开花凹]。但是对于其同源基因∞L来说，功能有 1．1．2酶及生化试剂 所不同。过量表达∞L1对开花时间几乎没有影 所有的限制性内切酶、质粒小提试剂盒、T4 响，但缩短昼夜节律，过量表达COL2对开花时间几 Ra公司；用于克隆的高保真TaqDNA聚合酶购自 乎没有影响[9]，过量表达COL9延迟开花[1…。将拟 MarkerDL2000 南芥CO基因导入马铃薯中，并在马铃薯中过量表 北京康为生物科技有限公司；DNA 达，发现所有转基因马铃薯表现出开花推迟的现 购自北京全式金生物科技有限公司；其他试剂均为 进口分装或国产分析纯。 象[111。拟南芥一个CO类似基因COL3，能感受红 光信号，并且能够促进根部生长[1引。C0的同源基I．2实验方法 因伙C03，在水稻中过量表达却能推迟水稻的开花 1．2．1 引物设计 时间‘13|。 根据Ms∞1基因(Access 隆载体序列，设计5对引物(表1)，其中C0l—f1和 RNA干扰(RNAinterference，RNAi)技术提供 了一种能直接有效地人为控制基因表达的方法， 它能够引起基因在转录水平的高效沉默，现已成 为验证未知基因功能和改良植物品质的有力工