葡萄、桃抗病基因同源序列的克隆与分析研究.pdfVIP

摘 要 本文根据NBS-LRR类和STK类杭病塞因的保守序列，采用塞于同源序列的候选基因法 对不同杭病性的4个桃种类和5个葡萄种类进行了杭病基因同源序列的克隆与分析，其结果 如下: 1.几种提取植物基因组DNA方法比较. 提取桃基因组DNA的实验中，参照乔玉山等人的改民SDS微量法，并将微量法改为 “中 量法”、即用Sml离心管代替1.5ml离心管，加大了植物材料用量;并相应地增加。NA样品 纯化次数;DNA溶解采用超纯无菌去离子水代替TE,最终获得了DNA浓度较大，质量较高的 桃基因组DNA，为进一步所做的PCR反应实验，提供了良好的塞础. 用SDS法提取葡萄塞因组DNA过程中，发现。NA样品有色素 (糖类物质)存在。于是 改采用CTAB法重新对葡萄基因组DNA进行了提取，并同样将微量法将改为 “中量法”，最终 既消除了色素的千扰，又获得了浓度较大，质量较高的葡萄基因组DNA. 提取桃基因组DNA过程中采用的Has。的浓度为1Omg/ml，完全消除DNA样品中的RNA 杂质，而在提取葡萄基因组DNA过程中采用的RNa”的浓度为O.lmg/ml,RNA杂质依然存在. 2.引物设计、PCR反应条件的优化和引物的筛选。 根据NBS-LRR类中的拟南芥抗丁香假单袍杆菌基因RPS2和烟草杭花叶A毒基因N中保 守的P一环(GGVGKTT)和跨膜结构域(GLPLAL)和STK类蛋白激酶的上游保守区(FG(K/V/I/S) VY(K/R)G)和下游保守区(D(V/D}YS(F/Y)G(V/I/M)，总共设计了13对简并引物，其中NBS-LRR 类引物组合9对，STK类引物组合4对. 以葡萄和桃基因组DN人为模板，设置M犷梯度，从1.Omm到4.5mM，每0.5mm为一梯度， 共8个M犷梯度，在此基础上，对常规PCR反应条件先后进行了优化:基因组DNA模板99-100 ℃彻底变性10分钟;热启动时间5分钟，温度95r-;退火温度设为低T。值引物的T。值5 ℃、Tm值低的引物用量提高到2.Oul 在优化的PCR反应体系下，13对所设计的简并引物中:NHS-LRR类引物组合WN3/WN5 在M广终浓度为3mM时，从5种葡萄材料中扩增出了清晰明显的特征条带;STK类引物组合 WS2/WS4在4种桃材料中、M犷终浓度也为3mM时，有模糊的扩增条带出现。 针对STK类引物，接着采用桃基因组DNA的PCR产物为模板进行再次PCR扩增，同时 将退火温度提高 最后在退火温度为43℃时，减少了PCR的非特异性扩增获得了清晰的特 征扩增产物 3.目的基因片段序列的分析。 回收PCR产物，连接转化，PCR检测后，进行测序，获得44个RCA序列，这些片段序 列的大小在 300-600bp之间.初步异同分析后，得出29个各不相同的片段序列，其中18 个来自蔺萄，11个来自桃.在随后的氨基酸序列分析中，有21个片段能推导出完整的氨基 酸序列.经氛签酸序列比较发现，发现它们除两端的引物序列外，都基本具有杭病基因所特 有的保守氛基酸结构域.即最终获得了21个杭病墓因同源序列，其中从葡萄中获得 15个 NBS-LRR类抗病墓因同源片段，从桃中6个STK类杭病基因同源片段 将这21个杭病基因同源序列进行聚类分析得:从5种葡萄中共获得6类NBS-LRR类抗 病基因同源序列;从4种桃中共获得4类STK类杭病基因同源序列.同时与已报道的相应同 源序列也进行聚类分析知:来自99R的p-12与已克隆到的.1a1基因的氨卷酸序列为一类， 来自Al的p-16与已克隆到的L6,从N的基因的氨基酸序列为一类;来自玻叶黄露的t-3. t-16与已克隆的Pto,Ll10基因的氛基酸序列为一类，其t-5与已克隆的Xs21基因的序列 为一类 然后将所获得的杭病基因同源序列之间、同时与已知抗病基因的氛墓酸序列进行了同 源性比较分析，发现所获得的杭病塞因同源序列总的来说与已知杭病基因的氛塞酸序列同源 性较低，多数没超过30%，而它们之间的同源性则相对较高，多在40%-60%之间 但也有个 别的氛基酸序列与已知杭病塞因的氛基酸序列同源性较高，从 5种葡萄中共获得 6类 NBS-LRR类杭病基因同源序列中，如来自AK1的p-16与抗病基因L6,M,N的同源性分别 为36.7%,32.7%,32.7%;来自”R的p-12与基因Xs/的氨叁酸序列同源性为42.7040 从4种桃中共获得4类STK类杭病塞因同源序列中，来自皱叶