猪口蹄疫病毒VP1基因和免疫串联片段F的克隆及其在Vero细胞中的表达研究.pdfVIP

————一 一 △堕茎堂生墨塑堕笙型壅堑些墨竖塑 猪口蹄疫病毒VP]基因和免疫串联片段F的克隆及其在Vero细胞中的表达 黄桂菊，罗满林·，刘镇明，贺东生，耿忠海 (华南农业大学善医学院，广东广州510642) 摘要：将猪口蹄疫病毒的VPI基因通过RT-PcR方法从细胞病毒液中扩增后克隆进pGEM-TE8sy载体，通 同时根据获得的猪口蹄疫病毒VPI基因的序列，结合相关的文献资料，设计合成免疫串联片段F，F含有 胞，通过间接免疫荧光分析，表明VPI基因和F基因均在Vero细胞中成功进行了瞬肘表达。为进一步研 制FMD基因疫苗奠定了基础。 关键词：猪口蹄疫病毒VPI基因克隆表达 diseaseVirus，F蛐v) 口蹄疫(Foot—and叫outhdisease，F如)是由口蹄疫病毒(Foot—aIld-Mouth 引起的偶蹄动物的急性、热性、高度接触性传染病。患病动物以口、舌、居、蹄、乳房和腹部皮肤等部位 出现水疱、溃疡、烂斑为主要症状。该病主要感染偶蹄动物．感染后发病率几乎达到100％，被国际兽疫 毒，病毒粒子直径为20～25m。完整的病毒粒子由衣壳和RNA两部分组成，无囊膜。衣壳由四种结构蛋 与中和抗体及抗感染有关的主要是VPI…。在已发现的0型五个抗原位点中，有三个位于VPI上，VPI是 两个肽段的序列有关，其中141～160位氨基酸处的G—H环是最主要的保护性抗原位点，空间构象比较复 表位复合体，至少存在4个具有诱导中和能力的B细胞抗原表位和一个辅助的T细胞表位。而200～213 着重要的作用”1。本研究从自行分离的一株猪口蹄疫病毒中扩增出VPI基因并成功构建真核表达质粒 瞬时表达，此研究为研制口蹄疫基因疫苗打下了基础。 1 材料与方法 i．i材料 i．1．i病毒与细胞：病毒为本实验室分离，BHK一21(中国仓鼠肾传代细胞)，陈金顶老师惠赠。 Easy载体购自Promega公司。 i．i．2菌株和质粒：DH5Ⅱ、pcDNA-3．1(+)本实验室保存，pGEM-T BRL公司产品：小牛血清购 1．I．3试剂：细胞基础培养基D删(highglycose)、RNA抽提试剂盒为GIBc0 DNA Marker 自杭州江滨生物工程有限公司：DNA回收纯化试剂盒为上海生工生物工程技术公司产品：1kb DNAMarker、DL2000 为北京鼎国生物技术发展中心产品；dNTP、1．5Kb DNA№rker及各种限制性内切酶 人畜共患传染病阱治研究新成果汇编 公司产品。脂质体(LipofectamineTM Purified Goat Fluorescein—Labeled Antibody anti—Swine 1．2方法 1．2．1病毒增殖：将病料接种3～4d龄乳鼠，死亡后收取胴体，连续传5代以提高病毒毒力，然后接种 一80℃保存备用。 1．2．2病毒RNA的提取：按GibcoBRL公司TRIzolLSReagentRNA提取试剂盒说明书进行。 增片段为678bp，覆盖完整VPI基因。 P1：5’GCC俐咒臻TGACCACCTCTGCGGGTG3’ (BamHI酶切位点) P2：5’CGAf化翎GrTAGTCGAAGTTCAGAAGC3’ (XhoI酶切位点) 引物5’端均加入酶切位点(下划线)和保护性碱基，由上海博亚生物技术有限公司合成。 1．2．4 cDNA的合成与克隆：按大连宝生