猪小肠粘膜抗菌肽的提取与纯化研讨.pdfVIP

图版8扫描电镜下49日龄实验组(A，500X)和对照组鸡(B，600X)十二指肠绒毛结构(SEM)， 示实验组鸡十二指肠绒毛粗圆指状，表面沟深(A)；对照组鸡十二指肠绒毛扁平叶状．表面沟浅(B)。 Fi98．Magnification ofvilliofduodenumof49·day-oldABP·treatedchicken(A)andcontrolchicken03)， theroundish fossaofABP-treated showing finger-shapedvillus，deep chicken(气500x)and theflat villus，shallowfossaofcontrol leaf-shaped chicken∞)(SEM)． 猪小肠粘膜抗菌肽的提取与纯化研究· 包汇慧佘锐萍刘天龙 (中国农业大学动物医学院基础兽医学北京100094) 摘要：采用酸浸提、离心、冻干等方法从生产肠衣的副产品猪小肠粘膜中获得抗菌肽粗提物，利用葡聚糖G-100凝 胶层析法对该粗提物进行纯化，然后采用Tticine．SDS检测层析纯化物的纯度，获得纯化的具有高生物活性的 抗茵肽提纯品，从而变废为宝，大大提高屠宰加工废弃物的利用率。 关键诃：猪小肠粘膜抗菌肽 提取 纯化 抗菌肽因具有稳定性强、不易分解、抗菌机理独特、对动物正常细胞无害等特点，近几年来， 已逐渐成为医学、动物医学、药理学及生理学等各领域研究的共同热点，而抗菌肽的提纯方法的改 进势必也提上了议事日程。本实验室一直致力于抗菌肽的提取与纯化工作，曾对猪小肠抗菌肽的提 取与纯化作过报道。本实验首次利用肠衣加工废弃物即刮取下来的肠粘膜作为原材料，提取抗菌肽， 为屠宰加工废弃物的高值化利用提供一个崭新的思路。 ’国家自然科学基金资助项目30471301) 6作者：包汇慧(1979)，女，基础兽医专业在读硕士，研究方向：肠道粘膜免疫和分子病理学 通讯作者：余锐萍，中国农业大学动物医学院教授，博士生导师。 1．材料与方法 1．1材料：新鲜猪小肠粘膜采自北京肉联厂。 1．2菌株：大肠杆菌078菌株购自中国兽药监察所菌种室：白色葡萄球菌由中国农业大学动物医学 院微生物实验室提供。 1．3．实验方法： 13．1猪小肠粘膜抗菌肽的提取与纯化将新鲜的猪小肠粘膜称取200克，4C预冷2小时，取出后匀 浆机匀浆3次。再用超声波细胞粉碎机将匀浆产物破碎10次，每次3秒。之后用恒温水浴锅100。C 隔水煮沸15分钟，取出后冰水浴，使其迅速冷却。弃去大的凝结块，按等体积比加入预冷的弱酸， 搅拌浸提24小时。次日将浸提液10，000转／分离心30分钟，取上清，4C保存。将沉淀再用等体 积预冷的弱酸浸提24小时。重复离心过程，取上清液。分别留取两次离心上清液各5ml做抑菌实验 后，合并上清液，将所得的产物用的氢氧化钠中和。将中和后的产物再次离心弃沉淀，上清液分装 后冷冻干燥。所得干燥产物即为抗菌肽粗提产物。 G．100凝胶层析柱层析，洗脱后用自动核酸蛋白检测仪 取一瓶分装的干燥粗提物，用Sephadex 检测洗脱物的吸收峰，并用自动记录仪记录OD280处的吸收峰，参照液为0．2mol／L的乙酸钠，用自 动收集器收集洗脱物，每管收集3ml。在吸收峰处的收集液进行抑菌活性检测。每管留取50／uL做抑 菌活性实验及电泳，其余的冻干保存。 1．3．2抑菌活性的鉴定按照LYan等(1998)报道的琼脂糖弥散法测定抑菌活性。所用测试菌分别 为大肠杆菌078，嗜水气单孢菌，沙门氏菌，巴氏杆菌，白色葡萄球菌。将配制好的，含1．2％琼脂糖， 加入调整好浓度处于对数生长期的大肠杆菌078，嗜水气单孢菌，沙门氏菌，巴氏杆菌，白色葡萄球 菌等测试菌(细菌终浓度为106CFI，，舶1)，待其冷却凝固后，在琼脂板上打直径为3mm的圆孔。孔 中加入20扯l的样品，不铺二倍琼脂，静置三十分钟待其吸收完全后倒置于37。C温箱中培养18小时， 观察抑菌环的大小，确定抑菌活性。 的方法，并对分离胶的浓度做以改进，以小分子量多肽标准蛋白作为参照。分离胶T为15．5％，C为 指示剂溴酚蓝到达胶的底部时，停止电泳，取出胶