猪胸膜肺炎放线杆菌（APP）分子生物学诊断方法的建立研究.pdfVIP

摘 要 猪胸膜肺炎 (Porcinepleuropneumonia)是由胸膜肺炎放线杆菌 (Actinobacilluspleuropneumoniae,APP)引起的一种接触性传染病。本文 从广东省不同猪群中分离到3株APP野毒株O(H株、Si株、DJ株)，通过 各种培养特性及凝集试验证明:JH株为血清1型APP,SJ株和DJ株为血 清7型APP. apxNA基因是新发现的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌 (APP)的RTX毒 素基因，根据apxNA毒力基因3端的核昔酸序列设计合成了一对引物， 建立了检测APP核酸的特异的PCR方法，该方法扩增片段大小为442bp. APP1-10血清型标准菌株DNA为模板进行PCR扩增结果均为阳性，A型 和B型多杀性巴氏杆菌、链球菌、支气管败血波氏杆菌、肺炎双球菌、金 色葡萄球菌、大肠杆菌及一些从猪肺脏分离到的细菌DNA为模板进行PCR 扩增均为阴性，以上结果显示本论文建立的APP核酸PCR检测方法特异性 较强。此外对PCR的反应条件进行了优化，结果显示:PCR反应的核酸检 出敏感性为2.88pg，反应具有较好的重复性和稳定性。用本论文建立的方 法对从广东省分离到的3株APP野毒株进行检A4，均可扩增出442bp的特 异条带，通过序列分析进一步确定JH株为血清1型APP,SJ株和DJ株为 血清7型APP. 以血清1型APP的apxNA毒素基因 (大小为442bp)的DNA片段为 模板制备地高辛标记核酸探针。敏感性检测结果表明，该探针对APPDNA 的最低检出量为1.8ng。特异性检测结果表明，该探针能与APP1-10血清 型标准菌株DNA抽提物发生特异性杂交反应，而与A型和B型多杀性巴氏 杆菌、链球菌、支气管败血波氏杆菌、肺炎双球菌、金色葡萄球菌、大肠杆 菌及一些从猪肺脏分离到的细菌DNA进行杂交反应均为阴性。对杂交反应 时间进行摸索发现杂交时间在10-20h效果最好。 应用PCR方法及斑点杂交法对临床 10份细菌分离阳性病料、31份细 菌分离阴性但有纤维渗出性病料和36份细菌分离阴性且无纤维渗出性病料 进行检测，结果阳性病料全部检出;对于31份细菌分离阴性但有纤维素性 渗出的病料，PCR法检测出20份为阳性，斑点杂交检出14份为阳性;36 份细菌分离阴性且无纤维渗出性病料PCR法及斑点杂交法检测均为阴性。 结果表明，PCR检测法及斑点杂交检测法都可用于APP各血清型及临床病 料的检测，但PCR法比斑点杂交法敏感度更高，操作更简便，成本更低， 时间更短，更适合在临床诊断中推广使用。 关键词:猪胸膜肺炎放线杆菌;斑点杂交;apxNA毒素基因:聚合酶链式 反应 缩写词 Ampicillin 氨节青霉素 a a AminoAcid 氨基酸 b P BasePair 碱基对 m c Centimeter 厘米 DNA DeoxyribonucleicAcid 脱氧核糖核酸 EB Ethidium Bromide 澳化乙锭 Hour 小时 Isopropylthio-P-D-galactoside 异丙基硫代一p-D一半乳糖普 KDa Kilodalton 千道耳顿 m g 毫克 h a Minute 分钟 m L Milliliter 毫升 OD OpticalDensity 光密度值 PCR