血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)活性测定(改良赖氏法).pptVIP

血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）活性测定（改良赖氏法） 第六小组 关于丙氨酸氨基转移酶ALT 转氨基作用 指的是一种α-氨基酸的α-氨基转移到一种α-酮酸上的过程。转氨基作用是氨基酸脱氨基作用的一种途径。其实可以看成是氨基酸的氨基与α-酮酸的酮基进行了交换。 谷丙转氨酶 谷丙转氨酶是临床上进行肝功能测试的一个标准，来确定肝脏是否健康。它也被叫做血清谷氨酸丙酮酸转氨酶（serum glutamate pyruvate transaminase，简称SGPT）或丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，简称ALAT）。诊断上，基本上都是以“单位每升”（U/L）为单位进行测量。 什么是改良赖氏法？ 卡门法 丙酮酸+α-酮戊二酸 谷氨酸+丙氨酸 丙酮酸→NAD++乳酸 在紫外分光光度法中，NADH在340nm波长处的吸光度降低值与ALT活性成正比。 卡门氏酶单位：1ml血清（反应溶液总量为3ml）在340nm波长下，用内径喂1.0cm的比色皿，在25摄氏度，1分钟内生成的丙酮酸，在乳酸脱氢酶催化下，使NADH+H+变成NAD+，光密度下降0.001为一个转氨酶活性单位。 赖氏法 改变了丙酮酸含量的测定方法 丙酮酸+2，4-二硝基苯肼 丙酮酸2，4 -二硝基苯腙+H2O 改良赖氏法 赖氏法的测定方法+卡门氏法的酶单位定义 实验目的 1.了解血清丙氨酸氨基转移酶活性单位的定义 2.掌握血清丙氨酸氨基转移酶活性测定的方法（改良赖氏法）和临床意义 实验原理 在实验条件下，以丙氨酸和 α- 酮戊二酸作为第底物，经转氨酶的作用，生成谷氨酸和丙酮酸，然后测定丙酮酸的生成量，即可计算酶活性的大小 实验原理 实验原理 尽管基质液中余下的a-酮戊二酸同样可生成红棕色苯腙硝醌化合物而影响测定结果，但因其量不多，加之对505nm的吸光度远不如丙酮酸生成的苯腙硝醌化合物强，尤其用标准曲线作测定时，所用的酶活性单位通过卡门氏分光光度速率法矫正，摈弃了赖氏法一些固有弊端，结果比其他比色法准确。故卫生部临检中心建议国内无条件使用连续监测法的单位使用赖氏法。1981年全国常规生化检验方法学术讨论会认为赖氏法测定ALT活性较为合理，全国肝炎协作会议也建议统一使用改良赖氏法。 实验试剂 1.ALT底物液：称取分析纯α-酮戊二酸39.2mg，丙氨酸1.78g，置于干净小烧杯内，先用50ml碳酸缓冲液（pH=7.4）溶解，然后用1mol/LNaOH校正pH至7.4（约需0.5ml），再以pH7.4的磷酸缓冲液稀释至100ml，加氯仿数滴，防止变质。 2.pH=7.4磷酸缓冲液（PBS）：称取磷酸氢二钠（Na2HPO4)13.97g及磷酸二氢钠（KH2PO4)2.69g溶解于1000ml蒸馏水中 3.丙酮酸标准液（2mmol/L）：准确称取干燥至恒重的丙酮酸钠22mg，以磷酸缓冲液洗入100ml容量瓶中，混合，再以磷酸缓冲液稀释至刻度。本液应新鲜配制。 4. 2，4-二硝基苯肼溶液（1mol/L）：称取2，4-二硝基苯肼19.8mg先溶于10ml 1.0mol/LHCL中，溶解后，加水至100ml。 5.0.4mol/LNaOH 实验操作 取干净试管12支，按下表所示标号，要求各S管和U管进行双管平行操作。先做对照管和测定管，在30min保温期间再做空白管和标准管 1.标准曲线绘制：取试管5支，按下表操作 混匀，室温放置10分钟后，以蒸馏水调零，用520nm波长比色，读取各管光密度。各管光密度减去0管光密度，然后以光密度的差值为纵坐标，各管相应的转氨酶活性单位为横坐标，绘制标准曲线。为了方便，可将光密度相当于转氨酶的卡门氏单位列于其后