食微第六章.ppt

DNA的复制 DNA semi-conserved replication Structure of antibody （二）噬菌体（phage）类型 原理： 根据噬菌体和它的宿主细菌之间的特殊关系，用已知的噬菌体鉴定其特定的宿主细菌。 （二）荧光抗体法（FA） （Fluorescence antibody） 1942年创立，在食品和医学微生物中应用广泛。 原理：抗体与荧光物质结合而带有荧光，与相应抗原结合后，在荧光显微镜下可以观察，也可计数。 荧光素： 异硫氰酸荧光素（FITC） 若丹名B（Rhodamine B） （三）沙门氏菌1-2实验（1-2 Test） 原理： 血清学原理 , 即抗原抗体结合形成 肉眼可见的免疫带。 一种检测有动力的沙门氏菌的方法 在一个特殊的含两个容器的塑料设备中进行： 一个容器中装有选择性液体培养基，另一个中装有非选择性运动性培养基（半固体），并含有鞭毛抗体。 恒温培养时，运动性沙门氏菌经选择性培养后进入非选择性培养基，并与其中的抗体结合形成免疫带。 Inoculation chamber 优点：将血清学反应和生化增菌过程结 合起来，特异性强； 不需特殊实验室条件，简便 ； 8-14小时内得出结果，快速 。 缺点：不能检测非运动型沙门氏菌， 免疫条带的判断有主观因素。 （四）酶联免疫吸附剂测定 Enzyme Linked Immunosorbent Assay 1971年Engvall和Perlmann （ ELISA） can measure antibodies or antigens inexpensive, rapid, quantitative, specific sensitive (pg/ml) expensive equipment not required can be automated ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及 抗原或抗体的酶标记。 结合在固相载体 表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性， 酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活 性，又保留酶的活性。 原理： 待测样品与固相载体表面的抗原或抗体起反应，加入酶标记的抗原或抗体也结合在固相载体上。此时固相上的酶量与样品中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成有色产物，产物的量与样品中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。 ELISA可用于测定抗原或抗体。测定中有三个必要的试剂： （1）固相的抗原或抗体，即“免疫吸附剂” （immunosorbent）； （2）酶标记的抗原或抗体，称为“结合物” （conjugate）； （3）酶反应的底物（substrate）。 固相载体 固相载体作为吸附剂和容器，不参与化学反应。最常用的是聚苯乙烯，具较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性，且价格低廉，故被普遍采用。 载体的形状主要有三种：微量滴定板、小珠和小试管。以微量滴定板最常用， 称为ELISA板，国际上标准的微量滴定板为8×12的96孔式。 ELISA Plate ELISA常用的酶： 辣根过氧化物酶 （Horseradish peroxidase, HRP） 碱性磷酸酶 （Alkaline phosphatase，AKP） Incubate, wash 1. Coat solid phase with antibody Main steps： 2. Block free binding sites. Incubate， Wash. 3. Add sample Incubate， Wash 4. Add conjugate E E Incubate， Wash. 5. Add substrate 6. Incubate, stop, measure colour change Colourless ENZYME OD Concentration ELISA Machine 应用： 1）沙门氏菌的检测 2）金黄色葡萄球菌及其内毒素检测 3）霉菌和真菌毒素的检测 4）大肠杆菌内毒素的检测 第三节 分子生物学方法 基因探针技术 DNA扩增法 限制性片段长度多态性技术 脉冲场凝胶电泳 1.基因探针技术 探针（Probe）：经过标记的一段 短核苷酸，用于检测与之同源的核 苷酸序列。 Probe is a short labelled nucleo