基因工程报告.ppt

* * A B C D Tester杂交液（Adaptor 1） A B C D Tester杂交液（Adaptor 2R） Driver cDNA （加热变性） A, B, C, D E 第二次消减杂交 实验流程 * * A, B, C, D 末端补齐 E A B C D E E 末端补齐 实验流程 * * A B C D E 加入共用PCR引物 E A, D: 不能被扩增 C: 线性扩增 B: 扩增受到抑制 E 5’ 3’ 3’ 5’ E 第一次PCR扩增 实验流程 * * 非特异性表达基因得到极大的扣除， 高效地富集了差异表达基因。 E 5’ 3’ 3’ 5’ 加入巢式PCR引物 E 第二次PCR扩增 实验流程 * 实验过程要点分析 * 琼脂糖凝胶电泳检测，RNA有两条明显的带28 S和18 S，亮度在2 : 1左右。 * 实验过程要点分析 * * 实验过程要点分析 * 1和3的亮度会低于2和4的亮度，但是亮度不能过低。 * 抑制性消减杂交结果分析 * 消减杂交效率分析 基因得到了极大的扣除 * 后续实验流程 * 纯化二轮PCR产物（cDNA消减库） T/A克隆，特异位点或平末端克隆到相关载体中，转化大肠杆菌 蓝白斑筛选和琼脂糖凝胶电泳检测 初步筛选出阳性重组克隆 测序后获得EST序列 BLAST 同源性分析 确认差异表达基因的EST序列 根据EST序列设计引物，获得全长cDNA 将获得全长cDNA克隆到相关表达载体上，进行基因功能分析。 * SSH 技术的优缺点 * 优点 （1）假阳性率低 （2）灵敏性高 （3）操作简便 （4）高效率 缺点 （1）对起始材料相对要求较多 （2）经过 RsaI 等限制酶消化 （3）不能同时对数个材料进行比较 * SSH 技术的局限性 * 美国的Wanh等对SSH技术的动力学特征的数理计算及实验研究表明, 要使SSH技术有效地扩增差异表达的基因, 必须符合两个条件: (1)在Tester中差异表达基因所占的百分比必须超过0.01%; (2)差异表达的DNA量超过正常表达的5倍以上, 即差异表达 基因在Tester中的量最少是Driver中的5倍以上。 * SSH 技术的应用 * 动物：SSH技术在动物上的应用体现在遗传育种、组织器官和 细胞的分化、生长发育、免疫调控、代谢调控等研究领域。 植物：SSH技术在植物上的应用主要包括两个方面:一涉及植物的生长发育及组织特异性研究;另一方面,在植物抵抗各种胁迫, 包括生物和非生物因素。 微生物：SSH技术主要用于鉴定微生物的特异性序列、研究微生物的致病性和耐药性、鉴定特定生长发育阶段差异表达的基因等。 Thank you！ * * * * * * Title of the Presentation can go here ? Title of the Presentation can go here ? Title of the Presentation can go here ? ? Title of the Presentation can go here ? Title of the Presentation can go here ? Title of the Presentation can go here ? Title of the Presentation can go here ? Title of the Presentation can go here ? Title of the Presentation can go here ? Title of the Presentation can go here ? Title of the Presentation can go here ? Title of the Presentation can go here ? Title of the Presentation can go here ? Title of the Presentation can go here Title of the Presentation can go here ? Title of the Presentation can go here ? Title of the Presentation can go here ? Title of the Presentation can go here ? Title of the Presentation can go here ? Title of the Presentation can go here ? Title of the Pr