常规细胞培养要点.ppt

常规细胞培养要点 初步掌握基本的无菌操作要领 养成良好的无菌操作习惯 形成可持续的实验环境 促进实验的顺利进行 操作准备 环境消毒 1 将实验所需大中小已高压灭菌枪盒，移液器，已高压灭菌铝制饭盒（内装1.5mlEP管或15ml，50ml离心管，5ml枪头等）放入无菌操作台。 2 无菌操作台及房间实验前紫外消毒半小时。 3 操作时关闭房间紫外，通风5-10min，关闭操作台紫外，打开风机及照明。 操作准备 实验准备 1 换上专用实验服和手套，并用消毒酒精消毒手套 2 用75%酒精擦拭放置显微镜的桌面及显微镜载物台并打开显微镜 3 打开CO2培养箱取出细胞置于显微镜上观察，以此决定进行何种操作。若发现细胞有污染，及时将其丢弃。（垃圾桶分干湿两种，带液体的东西弃于湿桶，请勿混弃） 4 用75%酒精擦拭无菌操作台的台面，从冰箱中取出1×PBS 1×Trpysin以及合适的培养基，用消毒酒精擦拭其外表面后放入操作台（培养基混匀确认其无浑浊） 贴壁细胞的换液与传代 换液 1 吸弃培养盘内的液体再换入新鲜完全培养液。大部分细胞 培养一般用DMEM+10%FBS,或用MEM,RPMI-1640。用其他特殊培养基的细胞可在ATCC网站查询或询问来源地。 2 盘内排除污染的情况外，若有较多悬浮物可用1×PBS洗一遍后再加新鲜培液。 3 放回培养箱 贴壁细胞的换液与传代 传代 1 吸弃上清，加入1×PBS清洗剩余培液后加入1×Trpysin进行消化，期间应将其放入培养箱，温度适于胰酶消化。时不时将其取出放镜下观察掌握消化进程（制定一个时间梯度，如：2min，5min，10min等）镜下观察细胞从多变体或梭状等皱缩为圆球状，轻敲盘边就飘起移动即为消化完全。 贴壁细胞的换液与传代 传代 2 加入完全培液终止消化，终止体积至少为1:1 1）实验目的仅为留种则从细胞悬液中取出一部分丢弃后再补足培液。若细胞对胰酶敏感则需要将剩下的细胞悬液移至离心管离心去上清后用培液重悬重新铺板。 2） 按实验要求分盘则需现对细胞进行计数。之后按计数结果计算后分入相应培养盘。 3） 将分好后的细胞放回培养箱 计数方法 用70%酒精清洁血红细胞计数板和盖玻片，镜头纸擦干； 取20μl细胞悬浮液小心地从盖玻片的边缘加入血红细胞计数板的两个室，通过毛细管作用，细胞悬浮液在血红细胞计数板和盖玻片之间均匀地分布；切勿加入过量，只要充满即可。 置入显微镜，用10倍的目镜和10倍的物镜观察细胞，统计其中四个大的方阵中的细胞数，如果细胞浓度太高，可稀释再统计，记住稀释的倍数； 细胞浓度=（四个方阵中细胞数之和/4）X 104 /ml，方阵上方和左边边缘的细胞可统计在内，但下方和右边边缘的细胞则不应统计，如有细胞团计为一个。 用70%酒精和蒸馏水清洁血红细胞计数板和盖玻片，镜头纸擦干。 计数方法 细胞计数板的基本结构和计数范围 血红细胞计数板(hemocytometer) 含有两个室，每个室被划分为9个方阵，其 中4个方阵有16个小方格，为0.1 mm3 或 1 x 10–4 ml，细胞浓度。 取决于已知 体积中的 细胞数 细胞的冻存与复苏 冻存 1 准备好冻存细胞所需的低温冰箱，液氮罐及液氮，细胞冻存管并写好标签：细胞名称，时间及保存人； 2 取对数生长期的细胞（融合度达70-80%），收集细胞前24h换液一次 3 吸出培养液，用PBS洗细胞一次，除去，加入1ml Trypsin-EDTA, 放入37℃保温3-5 min, 使细胞脱离底部； 4 离心细胞并重悬浮于10% DMSO/90% FBS 中，大约 1-5 x 106 cells/ml 5 每个冻存管中加入1ml细胞悬浮液，拧紧盖子 6 冷冻细胞应缓慢降温，可用装有异丙醇的冷冻盒(每两个小时温度下降10℃)，放入-20℃冰箱中过夜，第二天再转至-80℃冰箱，可保存数月，如需长期保存，应转至液氮中。 细胞的冻存与复苏 复苏 在37℃水浴中预热培养基； 将冻存的细胞从液氮中取出，迅速放入37℃水浴中至解冻，用纸巾擦干管外水分，70%酒精消毒； ）检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。 ）操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。 将细胞用移液管放入适量预热的培养基中，混匀，放入 37℃，5% CO2培养箱中培养； 由于细胞保存液中通常含有DMSO，对细胞生长有毒性，应除去。对于贴壁细胞，待其贴壁后，更换新鲜培养基；对于初始细胞，悬浮培养的细胞以及一些敏感细胞类型应及时通过离心除去DMSO 操作注意点 实验操作应在台面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操?作。 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶