第13章_电泳技术.ppt

第一节 电泳的理论基础 1.1 电泳 定义：电泳是荷电溶质在电场作用下发生定向泳动的现象。 由于各种物质所带电荷的数量不同，因而，在电场中运动的速度也不一样。电泳法就是利用这种运动速度的差异来进行分离、纯化各种物质的方法。 电泳分离主要有区带电泳、等电点电泳、等速电泳等。这些电泳法又根据是否使用凝胶载体分为凝胶电泳和自由流电泳。 自由界面电泳是利用胶体溶液的溶质颗粒经过电泳后，在溶液和溶剂之间形成界面，从而达到分离的目的 区带电泳也称支持电泳，是样品在惰性支持物上进行电泳的过程，因为有支持物得存在减少了界面之间的扩散程度和干扰的发生，而且多数支持物还具有分子筛的作用，更增加了电泳的分辨率，加上区带电泳简单易行，成为目前应用的主要的电泳技术。 1.2 电泳速度 a)自由溶液中的电泳速度 静电引力: f=E×Z 阻力: f=6πrην 当f＝f‘时，泳动速度为 由上式可知，相同带电颗粒在不同强度的电场里泳动速度是不同的。为了便于比较，常用迁移率代替泳动速度表示粒子的泳动情况。迁移率为带电粒子在单位电场强度下的泳动速度。若以表示迁移率：上式两边同时除以电场强度E，则得： b)凝胶中的电泳速度 凝胶具有分子筛的作用，可提高电泳分离度。常用的凝胶载体主要是聚丙烯酰胺凝胶，另外还有琼脂糖和淀粉等。聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺和交联剂聚合而成，凝胶的浓度 蛋白质的电泳迁移速率与蛋白质分子量的对数成线性关系， 可预测根据蛋白质的荷电性质以及分子大小和形状等产生的凝胶分子筛效应进行电泳分离的特性。 第二节 电泳的类型及其原理 影响电泳迁移率的因素 (1) 电场强度 电场强度是指单位长度(cm)的电位降，也称电势梯度。电场强度大，带电质点的迁移速率加快，但产生的热量大。 (2) 溶液的pH值 若溶液的pH值pI，则蛋白质带正电，在电场中向负极移动。溶液的pH值离pI越远，质点所带的净电荷越多，电泳迁移速率越大。 (3) 溶液的离子强度 电泳液中的离子强度增加时会引起质点迁移速率的降低。离子浓度过低，会降低缓冲液的总浓度及缓冲容量，影响质点的带电量，改变泳动速度。 (4) 电渗 在电场作用下液体对于固体支持物得相对移动称为电渗。由于固体支持物多孔且带可解离的化学基团，因此常吸附溶液中的正离子或负离子，使溶液相对带负电或正电。 2 凝胶电泳 凝胶电泳利用凝胶的分子筛作用使分子大小不同的电解质得到分离：相对分子质量大的溶质受到凝胶阻滞作用大，泳动速度较慢，而小分子溶质泳动速度较快。经过一定时间的电泳后，根据溶质相对分子质量的不同，凝胶中形成数条含有不同溶质的区带，实现溶质之间的相互分离。 凝胶电泳是以淀粉胶、琼脂或琼脂凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等作为支持介质的区带电泳法称为凝胶电泳。其中琼脂糖凝胶孔径较大，对一般蛋白质不起分子筛作用，但适用于分离同工酶及其亚型，大分子核酸等。 不连续凝胶电泳： 最基本的凝胶电泳的凝胶柱中凝胶浓度和pH值均一，为了提高凝胶电泳的分离性能，人们开发了不连续凝胶电泳法。 不连续凝胶电泳的凝胶层由浓度不同的两层凝胶组成。上层凝胶浓度较低，孔径较大，对溶质的泳动无阻滞作用，溶质在此层得到浓缩； 下层凝胶浓度较高，各组分根据荷电量和迁移率的差别得到分离。因此，上层凝胶称为浓缩层，下层凝胶称为分离层，在上层凝胶中溶质以等速电泳的形式泳动，得到浓缩。 等速电泳原理 定义：等速电泳是根据分子电荷的差别而不是分子大小差别来进行物质分离的。仅适用于同种电荷的分离。 原理:在上层凝胶层中，以迁移率最大的阴离子为前导离子（Cl-)，迁移率最小的阴离子为末尾离子（甘氨酸离子），以阳离子为反离子，电泳开始时，将含有目标蛋白质的料液加入到前导离子和末尾离子之间。 等速电泳特点 1)等速电泳中扩散的影响很小，可以忽略不计。 2)提高前导离子的浓度，可使溶质得到浓缩。 3)采用适当的低分子两性电解质，在目标蛋白质前后作用间隔物,可使目标蛋白与其他蛋白质完全分离，得到高度纯化。 分离特性 利用不连续电泳分离蛋白质，可改变各种操作参数优化分离过程。例如，调节pH值可改变荷电量Z，调节凝胶浓度可改变迁移率，调节电压可改变电泳速度等。因此，选择适当的操作条件，可进行各种蛋白质的分离。 3 等电点聚焦