酪氨酸激酶受体B基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定.pdfVIP

·370· ·方法与技术· 酪氨酸激酶受体B基因RNA干扰 慢病毒载体的构建与鉴定 李梅赵玉 井超耿德勤庄柏翔 樊红彬 【摘要】 目的构建有效抑制酪氨酸激酶受体B(TrkB)基因的RNA干扰慢病毒表达载体。方法 根据大鼠TrkB基因的不同部位设计4对短发卡RNA(shorthairpinRNA，shRNA)寡核苷酸片段，克隆到 慢病毒干手。÷载体pXZRNAi1．0中，构建shRNA慢病毒表达载体pXZRNAi—shTrkB一1，2，3，4。获得较高滴度 blot方法检测对TrkB的干扰效果。 的慢病毒颗粒后感染大鼠神经干细胞，应用实时荧光PCR和Western 结果酶切鉴定和测序结果提示慢病毒载体的寡核苷酸链插入正确。包装浓缩慢病毒颗粒的滴度为8．6 X105 cfu／m1．对神经干细胞感染效率可达80％。与未感染组相比，转染pXZRNAi—shTrkB一3和4的神经干 细胞中TrkBmRNA表达水平分别为(66．74-5．5)％和(76．84-4．9)％，TrkB蛋白的表达水平分别为(68．5 4-4．3)％和(78．24-5．1)％，均差异有统计学意义(P0．05)。结论成功构建可高效沉默TrkB基因的 pXZRNAi—shTrkB慢病毒载体，为研究TrkB在神经干细胞中的作用提供了有力工具。 【关键词】 酪氨酸激酶受体B；慢病毒载体；RNA干扰；神经干细胞 alentiviralvector RNAinterferenceof kinaseB Constructionandidentificationof mediating tyrosine gene L1 CenterBasic Mei．ZHA0Yu．JINGChao．GENG Bai—xiang．FANHong—bin．Laboratoryfor De．qin．ZHUANG Medical Medical 210029，China Sciences，NanjingUniversity，Nanjing Toconstructa kinase RNA Objective B(TrkB)targetedinterference(RNAi)lenti— 【Abstract】 tyrosine TrkB were andclonedintolentiviral viralvector．MethodsFour rat oligonucleotidestargeting gene synthesized vector 1．0toconstructrecombinantlentiviralvectors stemcells pXZRNAi pXZRNAi—shTrkB一1．2．3．4．Neural rat wereinfectedwiththese viruses．Real—timePCRwas todetect fromhippocampus high—titer employed prepared to the oftheserecombinants． theTrkBmRNA andwesternblotwasusedassessgenesilencingefficacy expression andDNA resultsdemonstratedthattheseshRNAswere insert