植物甜蛋白Brazzein基因的克隆与表达研究.pdfVIP

植物甜蛋白Brazzein基因的克隆与表达 摘 要 植物甜蛋白是指自然界中存在的具有甜味或可以引起甜味产生的蛋白质，迄今为止 已发现了7种，包括嗦吗甜 (Thaumatin)、莫奈林 (Monellin)、马槟榔 (Mabinlin)、 神秘果素(Miraculin)、喷塔汀 (Pentadin)、库克灵(Curculin)及布拉齐因 (Brazzein)。 甜蛋白作为一种天然非糖类的甜味剂，具有高甜味、低热卡、无毒、安全、多功能等优 点，有很高的营养价值、应用价值和经济价值。 Brazzein是从热带植物PentadiplandrabrazzeanaBaillon的果实中分离得到的甜蛋 白。它是由54个氨基酸组成的小分子量单链蛋白，分子量为6.5kDa，富含赖氨酸。丁 鸣等[[I]研究了Brazzein的特性和化学修饰，发现Brazzein含有8个Cys，形成了分子内 的4对二硫键，溶液等电点为5,Brazzein的甜度是等质量蔗糖的2000倍。与其它植 物甜蛋白相比，Brazzein的分子量最小，它具有良好的水溶性，其结构相对简单，并具有 良好的热稳定性和pH稳定性，它在85℃仍保持折叠形式，在80℃保持4h甜度没有减 弱，在高pH值的溶液中仍保持甜味活性。 迄今为止对Brazzein的一级结构和二级结构以及甜味机理研究比较充分，对于应用 上的研究比较少。为了获得大量纯度高的、具有生物学活性的Brazzein蛋白以满足基础 研究与工农业应用的需要，本文将Brazzein基因与PET系列原核表达载体进行了重组， 在大肠杆菌BL21(DE3)中初步进行了表达方面的实验研究。 1根据大肠杆菌偏爱的密码子，利用PCR技术体外人工合成BrazzeincDNA序列， 将其连入克隆载体T-easy中，测序结果分析表明扩增的片段为目的基因。 2.设计一对特异性PCR引物，导入适当限制性内切酶切点，以上述连有目的基因的 克隆载体为模板，采用PCR方法扩增基因片段，获得长度约180饰的Brazzein基因序 列。 3.将Brazzein基因进行双酶切后，连入原核表达载体pET-32a(+)和pET30a(+)中， 构建原核表达重组质粒pET-32a(+)-Brazzein和pET30a(+)-Brazzeino测序验证表达载体 构建正确后，以BL21(DE3)作为宿主菌，进行融合表达研究。 4.SDS分析表明，重组质粒pET32a(+)-Brazzein在IPTG诱导下表达分子量 约2bkDa的融合蛋白，约为菌体总蛋白的20%左右;重组质粒pET30a(+)-Brazzein在 IPTG诱导下表达分子量约 12kDa的重组蛋白，融合蛋白表达量约占菌体蛋白总量的 25%. 5.菌体采用溶菌酶裂解，融合蛋白以包涵体形式存在。 关键词:甜蛋白;Brazzein;基因克隆:基因表达 CloningandE ofBrazzein xpresslng Abstract [herearesevenknownsweet-tastingproteins:Thaumatin,Monellin, Mabinlin,Miraculin,Pentadin,CurculinandBrazzein.Theyhaveadvantageous propertiesofbeingnontoxic,lowcaloricandnoncariogenic.Sotheyhavethe probabilitytotakeplaceofsugar.Theseproteinscanelicitsweettastethough theirstructurearedifferentrfomeachother. Brazzeinoriginallyseparatedfrom thefruitoftheAfricanplant PentodiplandrabrazzeanaBaillon.Brazzeinisa6.5kDaproteinwithfour disulfidebonds.Brazzeinhasbeensequenced,itisasinglechainprotein.Itisthe smallest,mosthe