lecture-3---生物质谱与蛋白质分析.pptVIP

一、质谱的概念 在蛋白质组学的研究流程中，蛋白质鉴定是最关键的一环。如果说在蛋白质组分离技术方面出现各种方法并存的局面，那么，蛋白质鉴定的主流技术则无可争议的就是质谱技术了。 质谱(Mass Spectrometry, MS)：带电原子、分子或分子碎片按质荷比（或质量）的大小顺序排列的图谱。 随着人类基因组全序列的问世，以大规模分析细胞或生物体内的蛋白质为主要内容的蛋白质组研究成为后基因组时代的重要研究内容。蛋白质组计划的实施所必需的高通量、大规模筛选对分析方法又一次提出了挑战。而已发展了一百多年的质谱技术，由于其所具有的高灵敏度、高准确度、易于自动化等特点，为蛋白质组研究提供了关键的技术手段，成为蛋白质组研究的三大关键技术之一。 二、质谱技术的发展 自1886年Goldstein发明早期质谱仪器常用的离子源，到1942年第一台单聚焦质谱仪商品化，质谱基本上处于理论发展阶段。随后质谱在电离技术和分析技术上的发展和完善，使之很快应用于地质、空间研究、环境化学、有机化学、制药等多个领域。 真正意义上的变革是80年代中期出现的两种新的电离技术：电喷雾电离和基质辅助激光解吸电离。这两种技术所具有的高灵敏度和高质量检测范围，使得在fmol (10-15) 乃至amol (10-18) 水平检测相对分子质量高达几十万的生物大分子成为可能。 现今，质谱分析的足迹已遍布各个学科的技术领域，在固体物理、冶金 、电子 、航天、原子能、地球和宇宙化学、生物化学及生命科学等领域均有着广阔的应用。质谱技术在生命科学领域的应用，更为质谱的发展注人了新的活力，形成了独特的生物质谱技术。 三、质谱仪构造 质谱仪是一类能使物质粒子高化成离子并通过适当的电场、磁场将它们按空间位置、时间先后或者轨道稳定与否实现质荷比分离，并检测强度后进行物质分析的仪器。 质谱仪主要由进样器、离子化源、质量分析器、离子检测器、控制电脑及数据分析系统组成。 离子化源和质量分析器是两个中心部件，也是发展得最快的两个方面。 不同类型的质谱仪主要就是根据这两个部件来命名 如电喷雾(ESI)、快原子轰击质谱(FAB)是根据离子化源不同来区分； 而飞行时间质谱、四极杆质谱则是根据质量分析器来划分。 质谱仪的特点 1）真空系统： 离子源和质量分析器的压力分别在 10–4~10–5 Pa和10–5~10–6 Pa。 大量氧会烧坏离子源的灯丝。 用作加速离子的几千伏高压会引起放电。 引起额外的离子－分子反应，改变裂解模型，谱图复杂化。 2）进样系统： 在不破坏真空度的情况下，使样品进入离子源。 气体可通过储气器进入离子源。 易挥发的液体，在进样系统内汽化后进入离子源。 难挥发的液体或固体样品，通过探针直接插入离子源。 3）离子源： 分子失去电子，生成带正电荷的分子离子。 分子离子可进一步裂解，生成质量更小的碎片离子。 4）质量分析器 质量分析器是质谱仪的核心。 不同类型的质量分析器构成不同类型的质谱仪。 不同类型的质谱仪其功能，应用范围，原理，实验方法均有所不同。 5）检测记录系统 质量分析器分离并加以聚焦的离子束，按m/z的大小依次通过狭缝，到达收集器。经接收放大后被记录。 四、质谱技术原理及工作模式 质谱技术的基本原理：将样品分子离子化后，根据不同离子质荷比(m/z)的差异来分离并确定分子量。 主要步骤：首先是通过离子化装置将分子转化为气态离子；接着通过质谱分析器按照荷质比(m/z)不同进行分离；最后转化到离子检测装置。 离子化方法： 电子轰击电离 化学离子化 场电离，场解吸 快原子轰击 基质辅助激光解析电离 电喷雾电离 大气压化学电离 离子化的方法 1、电子轰击电离(Electron Impact, EI) 电子轰击电离又称为电子轰击，或电子电离。是应用最普遍，发展最成熟的电离方法。在EI离子源中样品受热呈气体或蒸汽状态，热阴极发射的电子经加速到70eV能量后飞向样品分子，使其由于失去电子而电离，进而碎裂产生碎片离子。生成的离子束由一加速电压（几kV）引出，进入质量分析器，按不同的质荷比（m/z）被分开，并检测器检出。 2、化学电离(Chemical Ionization, CI) 离子室内的反应气（甲烷等；10~100Pa，样品的103~105倍），电子（100~240eV）轰击，产生离子，再与试样分离碰撞，产生准分子离子。最强峰为准分子离子。 谱图简单。 不适用难挥发 试样。 Ionization Methods:Chemical Ionization (CI) Softer than EI: much less fragmentation Methane ionised by E